- Электрофорез
- Диагностика Необластом(ОПУХОЛЕЙ)
- Воспитание щенков и котят
- Кормление собак и кошек
- Чтобы не болеть
- Уход за зубами
- Уход за кожей и шерстью
- Блохи у кошек и собак
- Болезни морских свинок
- Болезни кроликов
- Состояние зубов
- Стрижка животных
- Удаление когтей
- Укус клеща у собак
- Переломы у собак, кошек
- Роды кошки и собаки
- Вопросы и Ответы
- Статьи
- Карта сайта
- covid19
- Исследования опухоли крысы(Роберта)
ЧАСТЬ ПЕРВАЯ.
Статья помещена на сайте 15 декабря 2013 года.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О БЕЗНОИТИЯХ И БЕЗНОИТИОЗЕ ЖИВОТНЫХ
КРАТКАЯ ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА
Впервые в мире, безноитиоз крупного рогатого скота был зарегистрирован в 1912 году во Франции Бенуа и Робином (Besnoit, Robin). Затем заболевание было описано Франком и Бергесом (Franko, Borges) в 1916 году в Португалии. В русскоязычных изданиях, до опубликования работ Б.П.Всеволодова в 1959, 1961 и 1966 года, о безноитиозе было лишь одно упоминание в руководстве В.Л.Якимова (1931 г.) о нахождении безноитий крупного рогатого скота во Франции и Португалии и дано краткое описание клинического проявления и морфологии паразитов, находящихся внутри сформированных цист. Из описаний тех лет важно отметить упоминание о том, что внутри кист (цист) «находится токсическое вещество, сходное с саркоцистином».
После открытия безноитий в природе, проблема безноитиоза изучалась во многих странах мира. Большой вклад в изучение безноитиоза крупного рогатого скота внёс Полс (PolsJ.W). В своей монографии опубликованной в 1960 году он дал монографический обзор основных достижений в области безноитиоза крупного рогатого скота за период с 1912 по 1960 годы. В этой работе автор довольно подробно описал морфологию B.besnoiti и подвёл как бы черту первого этапа изучения морфологии безноитий, их эндогенного развития, описываемых ранее Bеsnoit(1912), Franko (1916), Babudieri (1931). Благодаря работе J.W.Pols у исследователей появилось более или менее полное представление о морфологии B. besnoiti и их взаимоотношениях с организмом хозяина.
Работы Б.П.Всеволодова (1959; 1961;1966;1967), Э.И. Гаппарова (1966; 1965; 1967), И.У.Увалиева(1965;1967), М.В.Хван (1967;1968;1969), И.Г.Галузо (1967) стали как бы новым (вторым) этапом изучения безноитий и безноитиоза крупного рогатого скота в СССР. Они значительно пополнили знания не только о биологии паразита, но и о морфологии, патогенезе и эпизоотологии данного заболевания в Казахстане и республиках Средней Азии. А в своём обзоре И.Г.Галузо, М.В.Хван и Н.А.Безукладникова (1971) «БЕЗНОИТИОЗ – НОВОЕ В ВЕТЕРИНАРНОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ», авторы, практически, подвели итог многолетним исследованиям безноитиоза крупного рогатого скота в СССР.
На западе работы по изучению морфологии паразитических простейших относящихся к роду Besnoitia и их влияния на организм хозяина, практически, никогда не прекращались. За короткое время, после открытия в природе Besnoitia besnoiti (Besnoit, Robin,1912) были описаны ещё семь видов Besnoitia - B.darlingi (Brumpt, 1913); B.tarandi (Hadwen,1922; B.benetti (Babudieri,1932); B. jellisoni (Frenkel,1953); B.wallacei (Tadros and Laarman,1976); B.caprae (Njenga fnd all,1993); B.oryctofelisi (Dubey аnd all, 2003). У трёх видов безноитий - B.wallacei, B.darlingi и B.oryctofelisi была описана половая фаза размножения, которую паразиты проходят в эпителии кишечника кошек. К настоящему времени ещё неясно, обнаруженные паразиты представляют разные штаммы одного и того же вида, как это имеет место у Toxoplasma gondii или это разные виды безноитий. Так, например, молекулярные исследования филогенетического исследования B. besnoiti и B.caprae проведённые (John T.Ellis and all.,2000) в Австралии и Кении показали, что безноитии от антилопы гну и диких коз имеют одинаковые ДНК последовательности. Поэтому авторы пришли к выводу о том, что B. besnoiti и B.caprae представляют разные штаммы (популяции) одного и того же вида. Однако в биологическом плане эти два штамма отличаются тем, что рогатый скот не восприимчив к безноитиям выделенных от коз. Поэтому возникает вопрос можно ли считать этих паразитов разными штаммами одного и того же вида?
В 2010 году в Интернет появилась обзорная статья журнала EFSA (Италия) под названием «Bovine Besnoitiosis: An emerging disease in Europe». Авторами статьи (Mariano Domingo, Luis M.Ortega, Mo Salmon, Marcus Doherr) использаваны материалы учёных разных стран Европы – G.Alvarez – Garsia and P. Garcia - Lunar (Spain), G.Schares(Germany), B.Gottstein(Switzerland), P.Jacquiet (France), A.Gentile (Italy), H. Cortes (Portugal). В этой статье, практически, подведён итог всем исследованиям проведёнными в Европе за столетний период и представлена великолепно исполненная карта распространения безноитиоза крупного рогатого скота в Европе.
Из этого анализа важно отметить: Первое – безноитиоз крупного рогатого скота широко распространён в Европе и наносит значительный экономический ущерб животноводству; Второе – до 2010 года, никому ещё в мире не удалось установить дефинитивного хозяина для B.besnoiti.
В подтверждение вывода, что у B.benetti нет дефинитивного хозяина является экспериментальная работа Д.Diesing and all.(2011) опубликованная в журнале (Parasitology research, v.75,№ 2) под названием : «Besnoitia besnoiti: Studies on the definitive host and experimental infections in cattel». Авторы, в эксперименте, для установления дефинитивного хозяина у B.besnoiti., использовали 12 видов мясоядных животных и не у одного из них не обнаружили половую стадию развития паразита.
Особая дискуссия в 70 – годы прошлого столетия развернулась о месте токсоплазмид и в частности токсоплазм, безноитий и саркоспоридий в системе простейших. До этого времени безноитии были отнесены в группу паразитических простейших неопределённой природы. Wenyon (1926), один из ведущих протозоологов мира начала двадцатого века, например, даже сомневался в их протозойной природе. В конце 60 и в начале 70 годов двадцатого столетия было сделано два важных открытия: у токсоплазм и саркоспоридий была обнаружена половая фаза размножения сходная с эймериями; и было установлено, практически, идентичное морфологическое и электронно – микроскопическое строение трофозоитов токсоплазм, саркоспоридий, безноитий, изоспор, эймерий, гемоспоридий и пироплазм. Для сравнения ультратонкого строения трофозоитов T.gondii и одного из видов рода Besnoitia (B.jellisoni) мы приводим схему опубликованную в книге Dubey аnd all (1970) .
Рис.1. Схема ультратонкого строения трофозоитов Besnoitia и Toxoplasma. Рисунок взят из книги Dubey аnd all (1970).
Как видно на схеме электронно микроскопическое строение трофозоитов Besnoitia и Toxoplasma очень похожи. Наряду с ядрами, лизосомами, митохондриями и аппаратом Гольджи, на переднем конце трофозоитов хорошо виден так называемый «апикальный комплекс», включающий полярные кольца, коноид, роптрии, микронемы и субпелликулярные микротрубочки.
На основании схожести ультратонкого строения, особенно передней части паразитов, Н.Д. Левайн (Levine,1973) предложил в типе простейших образовать подтип Apicomplexa . Это предложение было положительно воспринято протозоологами мира. Однако в отношении низших таксонов паразитических простейших в предложенной системе, мнения учёных разошлись. Так, например, согласно систематике Н.Д. Левайна безноитии крупного рогатого скота (B.вesnoiti ) и токсоплазмы отнесены в семейство Eimeridae. А Т.В. Бейер и др.(1978) пошли ещё дальше. Они объединили всех паразитических простейших образующих тканевые цисты размножения, в одну группу и поместили в подсемейство Isosporinae и предложили называть их «цистообразующими кокцидиями». С этим категорически не были согласны ни профессор Д.Н. Засухин, основатель первой в СССР лаборатории токсоплазмоза при Институте эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи АМН СССР, ни академик И.Г. Галузо, который выделил до этого токсоплазм и токсоплазмоподобных паразитических простейших в отдельный отряд Toxoplamidae класса Sporozoa подкласса Coccidomorpha.
Необходимо особо подчеркнуть, что эти предложения и дискуссии развернулись сразу же после открытия у токсоплазм, а затем и у саркоспоридий половых фаз развития сходных (сходных, но не идентичных!) с таковыми у представителей семейства Eimeriidae. В то время ещё не был изучен жизненный цикл неоспор (N.caninum), были сомнения есть или нет половая фаза развития у B.вesnoiti. В настоящее время эти вопросы решены. Достоверно установлено, что жизненный цикл неоспор, практически, идентичен токсоплазмам, а у B.вesnoiti половая фаза развития отсутствует.
В связи с этим вновь остро встал вопрос о месте безноитий крупного рогатого скота (B.besnoiti) в подтипе Apicomplexa, равным образом, как и токсоплазм, саркоспоридий и неоспор. Неопределённость в систематическом положении токсоплазмид породила непонятную для ветеринарных и медицинских врачей терминологию, такую как «классические и неклассические кокцидии», «типичные и нетипичные коцидии», «цистообразующие кокцидии», «тканевые кокцидии», «облигатно – гетероксенные цистообразующие кокцидии» и т.д.(Бейер и др, 1978; Вершинин,1972). А Конев С.В. (2011 г.) уже даже ставит знак равенства между нозологическим названием «безноитиоз» и «кожный коцидиоз» крупного рогатого скота и называет безноитиоз “Dermatococcidiasis».
Примером терминологического словоблудия, например, является определение данное саркоспоридиям Т. В. Бейр в статье опубликованной совместно с А.И. Радченко в журнале Цитология 2006г. под названием «Изменение ультраструктуры миофибрилл языка овцы при заражении Sarcocystisovifelis» : «Саркоспоридии – паразитические простейшие, цистообразующие кокцидии рода Sarcocystis, обладающие облигатно – гетероксенным жизненным циклом … и.т.д.». При чём здесь «цистообразующие кокцидии?». Вся эта терминологическая чехарда привила, в конечном счёте, к трудности понимания не только сложившихся десятилетиями понятий, но и понимания патогенеза токсоплазмид, сложнейших взаимоотношений токсоплазм, безноитий, неоспор и саркоспоридий с организмом хозяина. А отсюда и к их гипо – или гипердиагностике, и естественно неправомерному лечению или вообще не лечению этих заболеваний.
Как правильно отметил видный украинский педиатр, доктор Комаровский ( 2011г.) количество стрессов возникающих у женщин из за неправильной терминологии и трактовки результатов исследований на токсоплазмоз удивительно велико. Дошло уже до полного абсурда, что некоторые практикующие врачи полагают, например, что токсоплазмоз является не опасным заболеванием для человека. А отдельные наиболее «продвинутые специалисты» даже считают за «счастье» заразится, например, токсоплазмами в раннем детстве, чтобы приобрести пожизненный иммунитет. Ярким примером того, что токсоплазмоподобные паразиты, такие как тоскоплазмы, саркоспоридии, неоспоры и безноитии резко отличаются от представителей эймерид, является возбудитель безноитиоза крупного рогатого скота B.bеsnoiti. Во – первых, у безноитий крупного рогатого скота не обнаружена вообще половая фаза развития ни по типу кокцидий, ни по типу других паразитических простейших. Во – вторых, в эндогенном цикле размножения B.bеsnoiti имеются стадии, которых нет ни у одного представителя так называемых «истинных или классических» кокцидий. Сообщение В.М. Петешева и Поломошного в 1974 о половой фазе развития у B.besnoiti никто в мире не подтвердил. К настоящему времени, достоверно установлено, что в организме восприимчивых животных безноитии встречаются только в виде трофозоитов, ядерных псевдоцист и цист размножения. Передаются паразиты от животного к животному механическим путём кровососущими насекомыми (Bigalкe,1960; Хван.1967).
Анализируя и резюмируя данные этих двух этапов исследований, нам бы хотелось рассмотреть их с небольшими собственными комментариями. Поскольку, полученные нами данные с помощью цитологических, гистологических, гистохимических исследований и флюоресцентной микроскопии, значительно дополняют имеющийся в литературе фактический материал по морфологии, размножению и паразито-хояинным отношениям при безноитиозе крупного рогатого скота.
МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА B.besnoiti ВИДИМАЯ В МАЗКАХ - ОТПЕЧАТКАХ И ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗАХ
В эндогенном цикле размножения и развития B. besnoiti, чётко выделяются три фазы бесполого размножении. Две фазы внутриклеточного размножения в лейкоцитах крови и клетках РЭС - это фаза пролиферации трофозоитов и псевдоцист, и третья фаза внеклеточного размножения, которая завершается образованием тканевых цист размножения. Все стадии развития и размножения B.besnoiti в организме крупного рогатого скота строго детерминированы генетически и не зависят от иммунного статуса организма хозяина.
ТРОФОЗОИТЫ B.besnoiti–это бесполые, активно размножающие паразиты. Встречаются трофозоиты, преимущественно, в острую и подострую фазу заболевания, а также при обострении хронического течения болезни. Трофозоиты B.besnoiti - это строго внутриклеточные паразиты с преимущественным внутриядерным размножением. Однако они могут циркулировать по кровеносным и лимфатическим сосудам, как внутри клеток (лимфоцитов, моноцитов и сегментоядерных лейкоцитов), так и внеклеточно (Фото 1)
Фото 1. Гистологический срез основы кожи взятой у бычка №1 в подострую фазу болезни. Показана вена, в просвете которой, видно скопление безноитий (паразитарный эмбол). Окр. Гематоксилин – эозином.
Поэтому в фазу безноитиозного сепсиса, трофозоиты с током крови и лимфы заносятся в любой орган и любую ткань. Б.П.Всеволодов и Э.И. Гаппаров(1966) сообщают об обнаружении безноитий в эндотелиальных и адвентициальных клетках кровеносных и лимфатических сосудов различных органов, включая и головной мозг, а так же в гистиоцитах интерстициальной ткани, в спленоцитах селезёнки и эндотелии синусов лимфатических узлов. В подострую и хроническую фазу течения болезни, по непонятным причинам, трофозоиты, практически, покидают внутренние органы и поселяются, преимущественно в дерме животных, склере, слизистой влагалища, а у быков – производителей в коже, паренхиме и строме семенников.
В мазках – отпечатках, трофозоиты видны в виде чётко контурированой гомогенной цитоплазмы, внутри которой можно различить ядро, дающее положительную реакцию на ДНК (реакция Фёльгена). Расположение ядер в цитоплазме не постоянно. Большей частью встречаются паразиты с центрально расположенным ядром, но среди них можно видеть, паразитов, ядра которых сдвинуты к одному из полюсов, чаще к тупому краю (Фото 2).
Фото 2. Мазок – отпечаток скарифицированной кожи бычка №1. Видна группа безноитий удлинённой формы, с заострёнными концами. Ядра паразитов, в большей части расположены в центре клетки(показано одной стрелкой). У части безноитий ядра сдвинуты к одному из концов клетки (показано двумя стрелкаии). Окраска по Романовскому – Гимза.
Вот как описывают морфологию трофозоитов безноитий И.Г.Галузо и М.В. Хван в своём обзоре, опубликованном в 1971 году: «Размер трофозоитов 5 – 9 мк. длины и 2 – 5 мк. ширины. Они имеют овально – вытянутую форму с несколько заострённым концом, чаще встречаются слегка согнутой формы и тогда паразиты напоминают вид банана. Внутри клетки паразита, ближе к её притуплённому концу, расположено компактное, довольно крупное Фёльгин положительное ядро. По отношению к краскам трофозоиты грамотрицательны. В тоже время они хорошо красятся по Романовскому – Гимза, как и все простейшие организмы: цитоплазма в голубой, ядро в тёмно – фиолетовый цвет. Ядро паразита расположено чаще в центре клетки или несколько сдвинуто в сторону утолщённого конца. В овальных формах трофозоитов можно видеть два ядра. В капле физиологического раствора под микроскопом можно наблюдать их слабую подвижность. Трофозоиты безноитий, расположенные внутри инвазированных клеток, принципиально неотличимы от внеклеточных, они чаще округлой формы и несколько меньших размеров». Наряду с бинарным делением авторы описывают и множественное деление трофозоитов на 4 – 8 дочерних клеток по типу шизогонии сходной по описанию с таковой наблюдаемой рядом исследователей у трофозоитов токсоплазм (В.Л. Якимов, 1933; Е.М. Хейсин, 1968; А.М. Бугаев, 1969; 1974; 2005).
В гистологических срезах, по нашим наблюдениям, безноитии форму сохраняют, однако их размеры значительно меньше, чем в мазках – отпечатках. Эти различия связаны с фиксацией патологического и биопсийного материала. Ядра, у большинства паразитов расположены в центре клетки, но нередко, видны безноитии, ядра которых сдвинуты к тупому краю паразитарной клетки (Фото 3).
Фото 3. Гистологический срез дермы бычка №1. Видно большое количество внеклеточных трофозоитов B.besnoiti среди клеток воспалительного пролиферата. Паразиты, в основном, имеют полулунную форму, однако среди них можно видеть и овальные паразиты. Как у первых, так и у вторых - ядра чётко контурированы и расположены в центре клеток. Окр. Железным гематоксилином и эозином.
Трофозоиты бесноитий – это строго внутриклеточные паразиты. Развиваться, и размножаться они могут только внутри клеток хозяина. Отличительной особенностью безноитий от токсоплазм и других токсоплазмид является то, что они нашли благоприятные условия для своего развития и размножения не только в цитоплазме клеток, но и в их ядрах. Если для токсоплазм внутриядерное размножение редкое явление, то для B.besnoiti это один из способов внуриклеточного размножения. Для B.besnoiti нет таких клеток и тканей организма крупного рогатого скота, в ядрах которых они не могли бы размножаться, включая и клетки РЭС - гистиоциты, эндотелий и адвентициальные клетки лимфатических и кровеносных сосудов (фото 4,5, 6).
Фото 4. Гистологический срез кожи бычка, подострая фаза болезни. Видны разные стадии размножения безноитий в клетках воспалительного пролиферата - внутриядерное размножение безноитий в гистиоците (показано двумя стрелками) и в цитоплазме лимфоцитов (показано стрелками). В паразитах чётко можно различить ядро и цитоплазму. Окр.Железным гематоксилином и эозином.
Фото 5. Гистологический срез дермы бычка №2. Показана группа инвазитованных клеток воспалительного пролиферата образовавшегося вокруг артерии. Инвазированные ядра, морфологически резко отличаются от нормальных фибробластов. Окр.Гематоксилин – еозином.
Фото 6. Гистологический срез кожи бычка №1. Показан участок клеточного пролиферата в сосудистом слое дермы. Наряду с внутриядерным размножением безноитий в лимфоцитах и гистиоцитах (показано стрелками), хорошо видны делящиеся паразиты в цитоплазме плазмобласта. Окраска железным гематоксилином и эозином.
Проведённые нами цитохимические и люминисцентно – микроскописеские исследования внеклеточных трофозоитов в гистологических срезах и мазках – отпечатках, приготовленных от животных в подострую фазу заболевания, позволило выявить повышенный уровень РНК и общего белка в их цитоплазме. Это позволяет сделать вывод о метаболитической и пролиферативной активности трофозоитов безноитий в фазу подострого течения болезни.
ПСЕВДОЦИСТА – Термин «псевдоциста» был введён в паразитологию в средине 50 годов прошлого столетия в связи с изучением эндогенного размножения токсоплазм в организме животных и в культуре тканей. Было замечено, что в одних случаях, токсоплазмы в клетках организма хозяина размножаются путём бинарного деления (путём эндодиогении) образуя в цитоплазме инвазированной клетки парные организмы, свободно располагающие в цитоплазме инвазированной клетки (Фото 7);
Фото 7. Показано внутриклеточное размножение токсоплазм в мезотелиальных клетках брызжейки белой мыши. Токсоплазмы в цитоплазме инвазированных клетках расположены, более или менее, свободно, тогда как в псевдоцистах мерозоиты плотно упакованы. Окр. По Романовскому – Гимза.
в других – токсоплазмы размножаются путём нескольких повторных делений «полиэндодиогенией» или шизогонией. В результате чего, в инвазированной клетке образуется группа, плотно прижатых друг к другу паразитов, окружённых общей паразитарной оболочкой. Такие скопления паразитов назвали «Псевдоцистой». Дочерние клетки, образовавшиеся в результате эндодиогении и полиэндодиогенией, стали называть «эндозоитами», а в результате шизогонии – «мерозоитами». Этой терминологии мы будем придерживаться и при написании данного обзора.
Таким образом, псевдоциста B.besnoiti представляет собой скопление плотно прижатых друг к другу мерозоитов удерживающихся ядерной мембраной. Разница между псевдоцистой токсоплазм и безноитий состоит в том, что токсоплазмы образуют псевдоцисты в цитоплазме клеток организма хозяина, а безноитии в их ядрах. Морфологически, цитоплазматическая псевдоциста напоминает перстень. Только в этом перстне, вместо золотого ободка с бриллиантом, виден эозинофильный ободок цитоплазмы и в ней полулунной формы сдавленное ядро. (фото 8, 9).
Фото 8. Типичная цитоплазматическая псевдоциста T.gondii в клетке Купфера печени экспериментально заражённого щенка. Окраска железным гематоксилином и эозином.
Фото 9. Типичная ядерная псевдоциста B.besnoiti в дерме бычка. В кариоплазме видны мерозоиты содержащие различное количество хроматина, что свидетельствует о разных стадиях бинарного и множественного деления. Окраска железным гематоксилином и эозином.
Образование псевдоцист у токсоплазмид является одной из закономерностей эдогенного размножения и развития паразитов. Эта фаза обусловлена, по - видимому, генетически. За фазой псевдоцисты следует фаза внеклеточного размножения и развития B.bеsnoiti и формирования тканевых цист размножения.
ТКАНЕВАЯ ЦИСТА – это последняя фаза эндогенного размножения и развития B.bеsnoiti в организме крупного рогатого скота. Она образуется в результате сложного взаимоотношения внеклеточной колонии паразитов с организмом хозяина (Фото 10).
Фото 10. Гистологический срез дермы кожи коровы при хроническом течении безноитиоза. Показана зрелая двухслойная циста, содержащая большое количество мерозоитов и рядом участок гомогенной массы (Показано стрелкой). Окр. Железным гематоксилином и эозином.
Судьба паразитов, образовавшихся в цисте двояка. В лучшем случае, они каким - то образом (с помощью кровососущих насекомых или половым путём) попадают в организм других восприимчевых животных и продолжают бесполый путь размножения, тем самым поддерживая циркуляцию вида в природе. В худшем случае - паразиты погибают вместе с животным; в лучшем случае для крупного рогатого скота, при улучшении его здоровья и повышения резистентности организма, паразиты в цисте подвергаются дистрофии и фагоцитируются лейкоцитами и клетками РЭС. В таких случаях на месте цист образуется продуктивная гранулёма (Фото. 11).
Фото 11. Гистологический срез дермы коровы. Погибающая циста B.bеsnoiti, окружённая большим количеством клеток воспалительного пролиферата при хроническом течение безноитиоза. Окр. Гематоксилин - эозином.
В паразитохозяинных отношениях при безноитиозе крупного рогатого скота, между организмом хозяина и паразитами возникает парадоксальная, на первый взгляд, ситуация. Вначале эндогенного цикла развития безноитий, лейкоциты крови и клетки РЭС являются питательной средой для паразитов, а в конце эндогенного цикла эти же клетки становятся могильщиками для этих же паразитов. Но этот парадокс становится понятным при более тщательном изучении размножения и формирования цист B.bеsnoiti в организме крупного рогатого скота.
ОБРАЗОВАНИЕ ЦИСТ B.bеsnoiti В ОРГАНИЗМЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
В отношении образования тканевых цист токсоплазмид, и в частности цист B.bеsnoiti, до сих пор нет единого мнения. Основные гипотезы были высказаны ещё в средине прошлого века и до сих пор являются ведущими. Так, Френкель и Полс (Frenkel, 1953; Pols, 1954, 1960) считают, что размножение и образование тканевых цист B.bеsnoiti происходит в две фазы. Первая фаза протекает в цитоплазме клеток крови – нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов, в которых они делятся путём повторного бинарного деления до разрыва инвазированной клетки. Эндозоиты покинувшие разрушенную клетку хозяина, затем вновь внедряются в новые клетки, но теперь уже в цитоплазму гистиоцитов и дают начало второй фазе размножения – фазе образования тканевых цист. По их наблюдениям инвазированные гистиоциты увеличиваются в размере и удерживают колонию паразитов до образования внутри цитоплазмы гистиоцита цисты с прочной оболочкой. По их данным, реакция клетки хозяина на внедрение паразита проявляется делением ядра инвазированного гистиоцита, увеличением его цитоплазмы, причём цитоплазма такого гистиоцита увеличивается до гигантских размеров. А цитоплазматическая оболочка, преобразуясь, всё это время, удерживает колонию паразитов. Затем, вокруг цитоплазматической оболочки формируется толстая, гомогенная оболочка цисты. Полс (1960), Френкель (1969) на основании серии цитохимических исследований пришли к выводу, что наружная, толстая оболочка цист, образуется за счёт продуктов тканей хозяина, как ответная реакция на внедрение паразита в цитоплазму гистиоцита. Фибриллы соединительной ткани, обволакивающие пораженные клетки, составляют основу строения стенки цисты.
Несколько другой точки зрения придерживается Б.П. Всеволодов (1959). Он пришёл к выводу, что тканевые цисты B.bеsnoiti образуются из одной внеклеточной споры (по – видимому речь идёт о внеклеточном развитии и размножении трофозоита, прим. автора) путём гипертрофии цитоплазмы паразита и многократного деления их ядер. Он так описал образование тканевых цист B.bеsnoiti в коже крупного рогатого скота: «… Наконец, в некоторых стадиях мы видим, как отдельные ядра паразитов распадаются на большое число отдельностей – спор, имеющих форму короткого, слегка изогнутого веретена с заострёнными концами. Цитоплазма споры бледно окрашивается эозином, а в центре её видно красящееся гематоксилином зёрнышко ядерной субстанции. Более зрелые кисты, характеризуются наличием широкой, чётко контурированной гомогенной оболочки окрашиваемой по Ван – Гизону в красный цвет. Размеры кист заметно увеличиваются. Полость их постепенно заполняется густым скоплением свободно лежащих спор. Это скопление имеет форму шара, в некоторых кистах почти целиком выполняющего полость. Между ними и наружной стенкой остаётся лишь тонкий прерывистый слой из ряда уплощённых тёмноокрашенных ядер. Некоторые картины, наблюдающиеся в срезах, дают основание говорить об образовании новых кист путём отпочковывания их от старых».
Надо подчеркнуть, что эти представления о развитии и образовании тканевых цист безноитий сформировались в то время, когда не были ещё открыты половые фазы размножения у токсоплазм и саркоспоридий. Ничего не было известно о неоспорозе собак, неоспорозе сельскохозяйственных и диких животных. Да и вообще, в средине 50 – годов прошлого столетия мало, что было известно о токсоплазмидах и токсоплазмидозах. Повышенный интерес к токсоплазмидам и проблеме токсоплазмидозов произошёл после описания Hutchison и др.(1969) половой фазы развития у токсоплазм. После этого открытия к изучению проблемы токсоплазмидозов включились многие лаборатории мира. Основные фундаментальные исследования были проведены в США, Великобритании, Германии и СССР. За короткий промежуток времени были изучены жизненные циклы, практически, всех токсоплазмид. Все эти исследования проводились с подсознательным сравнением на эндогенный цикл размножения токсоплазм, поскольку к этому времени морфология и размножение токсоплазм были изучены довольно хорошо. Мы в этом обзоре так же будем придерживаться такого сравнения, но только не подсознательно, а сознательно, поскольку в нашем распоряжении имеется большой и уникальный экспериментальный материал по морфологии токсоплазм, их эндогенному размножению и взаимоотношению токсоплазм с организмом хозяина.
На биопсийном материале кожи, нами прослежено два способа формирования тканевых цист B.bеsnoiti. Первый и основной – это когда циста образуется после внеклеточного размножения и развития колонии паразитов, второй – когда инвазированное ядро - псевдоциста превращается в цисту. Кожа бралась нами у четырёх животных каждые 30 суток, на протяжении года при подостром и хроническом течения безноитиоза. Начальный возраст исследованных животных был - у двух бычков 9 – 11 месяцев, у одной тёлки 10 месяцев и одной коровы 4 –х лет. Все животные были спонтанно заражены B.bеsnoiti и превезены в Институт зоологии АН. Каз.ССР. из неблагополучных хозяйств Талды – Курганской области (Прибалхашья). Животные были пронумеровыны - бычёк №1 (возраст 9 месяцев), бычок №2 (возраст 11 месяцев), тёлка №3 и корова №4.
ФАЗА ВНЕКЛЕТОЧНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ЦИСТ В. bеsnoiti
Фаза внеклеточного образования цист начинается с того, что безноитии, после нескольких стадий размножения в цитоплазме клеток крови, покидают лейкоциты и затем проникают в ядра клеток РЭС и ядра других клеток организма хозяина. Проникнув в ядра клеток, паразиты интенсивно размножаются в кариоплазме, формируя ядерные псевдоцисты. При этом цитоплазма инвазированной клетки, вначале, незначительно гипертрофируется. В ней отмечается повышенное содержание РНК и общего белка. Однако затем, она (цитоплазма) и окружающая её ткань подвергается гидролизу и превращается в гомогенную, бесструктурную слизистую массу. В результате такого процесса, все вещества, синтезированные гипертрофированной цитоплазмой, оказываются в гомогенной массе, а ядро – псевдоциста, свободно располагается в ней (Фото 12, 13).
Фото 12. Гистологический срез основы кожи бычка №1. (Первое взятие биопсийного материала). Показано инвазированное ядро и вокруг гомогенизированная окружающая ткань, дающая положительную реакцию на слизь. Рядом видна хорошо сформированная циста и большое количество клеток воспалительного инфильтрата. Окр. Метиленовым синим.
Фото13. Гистологический срез дермы бычка №2. В гомогенизированной массе видно крупных размеров ядро- псевдоциста с размножающимися мерозоитами. Контуры ядерной оболочки хорошо сохранены, контуры цитоплазмы не выявляются. Окр. Железным гематоксилином и метеленовым синим.
Нередко в гомогенизированной массе оказывается два и более инвазированных ядер. При этом хорошо прослеживается активное деление паразитов внутри ядер, о чём свидетельствует морфология ядер и цитоплазмы паразитов. Ядра безноитий заметно увеличены в размере, при окраске железным гематоксилином они окрашиваются базофильно. Вокруг ядер паразитов видна широкая зона цитоплазмы, дающая резко положительную реакцию на РНК и общий белок. На деление паразитов в кариоплазме инвазированной клетки, так же указывает их резко положительная реакция Фёльгина (Рис. 14, 15, 16).
Фото 14. Гистологический срез дермы бычка №1. Большое количество ядер воспалительного пролиферата инвазированые безноитиями. В отдельных паразитах отчётливо можно видеть увеличенное ядро и широкую зону цитомлазмы. Окраска железным гематоксилином и метиленовым синим.
Фото. 15. Гистологический срез дермы бычка №1. Показан очаг воспалительного пролиферата. Большая часть ядер гистиоцитов, моноцитов и фибробластов инвазированны безноитиями. Инвазированные ядра дают резко положительную реакцию на ДНК и заметно выделяются по своей окраске и форме. Окр. По Фёльгену.
Фото 16. Общий вид дермы бычка №1 при безноитиозной инвазии и окраске по Фёльгину. В гомогенной массе показаны увеличенных размеров ядра-псевдоцисты, дающие резко положительную реакцию на ДНК. Рядом с формирующимися внеклеточно цистами хорошо видна зрелая циста.
Выше было сказано, что безноитии могут инвазировать любые клетки организма – хозяина (Frenkel, 1953; Pols, 1954, 1960). Б.П. Всеволодов (1959) изучая гистосрезы дермы крупного рогатого скота, обнаруживал цисты безноитий в пучке нервных волокон и под его оболочкой. Мы в фазу подострого и хронического безноитиоза наблюдали инвазию не только ядер белых элементов крови и клеток РЭС, но и ядер росткового и зернистого слоя многослойного плоского эпителия (Фото 17), а так же ядер пучков гладкомышечных волокон дермы (Фото 18, 19).
Фото.17. Гистологический срез многослойного плоского эпителия бычка №2, подострое течение болезни. Показано формирование цист безноитий непосредственно в многослойном плоском эпителии. Хорошо видно, что гидролизу подвергаются клетки росткового, шиповатого и зернистого слоя эпидермиса. Окр.Гематоксилин – еозином.
Фото 18. Гистологический срез дермы бычка №1. подострая стадия болезни. Показано формирование цист по ходу пучка гладкомышечных волокон. Видна циста с ещё не чётко контурированной оболочкой и рядом с ней множество инвазированных ядер гладкомышечных волокон. Окр. железным гематоксилином и эозином.
Фото. 19. Деталь фото 18. Во многих ядрах хорошо видны паразиты с чётко контурированной цитоплазмой и ядом.
После того, как в ядерной псевдоцисте образуется большое количество мерозоитов, паразиты покидают псевдоцисту и выходят в гомогенизированную массу. С этого момента начинается внеклеточное размножение и развитие паразитов, но уже в составе колонии (Фото 20, 21,22).
Фото 20. Гистологический срез кожи бычка №1 взятой в подострую фазу течения безноитиоза. Показан выход мерозоитов из ядерной псевдоцисты в гомогенезированную массу. На периферии гомогенизированной массы видны инвазированные ядра. Окраска железным гематоксилином и эозином.
Фото 21. Гистологический срез кожи тёлки №3, подострая фаза болезни. Показан выход мерозоитов безноитий в гомогенную массу. Окраска гематоксилин – эозином.
Фото 22. Гистологический срез дермы бычка №2. Показана молодая колония мерозоитов, вокруг которой окружающая ткань превращена в гомогенную бесструктурную белковую массу. Окраска гематоксилин – эозином.
Можно наблюдать картины, свидетельствующие о выходе паразитов из двух и более ядерных псевдоцист (Фото 23). Вопрос, что заставляет мерозоитов B.bеsnoiti покидать псевдоцисту и формировать колонию вне клетки на сегодняшний день остаётся открытым. Мы полагаем, что ядерные псевдоцисты безноитий, так же, как и цитоплазматические псевдоцисты токсоплазм являются генетически детерминированной стадией внутриклеточного размножения и развития паразита. За этой стадией, у B.bеsnoiti , как и у токсоплазм начинается колониальная, внеклеточная фаза размножения и развития паразитов. Только у B.bеsnoiti она выражена демонстративнее, чем у токсоплазм и саркоспоридий.
Фото.23. Гистологический срез дермы бычка № 1. Виден выход мерозоитов в гомогенную массу из трёх ядерных псевдоцист. Гомогенная масса вокруг псевдоцист окрашена в слабо фиолетовый (базофильный) цвет. Это свидетельствует о наличии в ней не только белков, но и нуклеиновых кислот. Окр. Железным гематоксилином и эозином.
Судьбу безноитий, покинувших ядерную псевдоцисту, можно проследить на серийных гистологических срезах. После выхода паразитов в гомогенизированную массу, безноитии продолжают размножаться. Это подтверждается морфологией ядер, а так же наличием в них увеличенного количества Фёльгин (ДНК) положительного материала (Фото 24).
Фото 24. Гистологический срез дермы бычка №1. В гомогенной массе видны ядра – псевдоцисты дающие резко положительную реакцию Фёльгена.
В результате выхода безноитий из ядерных псевдоцист и дальнейшего их внеклеточного размножения, количество паразитов в колонии увеличивается до огромного числа (Фото 25,26, 27).
Фото 25. Гистосрез дермы бычка №2, подострая фаза течения болезни. Рядом с хорошо сформированными цистами видна большая внеклеточная колония паразитов. Оболочка вокруг колонии отсутствует. В колонии, паразиты продолжают размножаться, но уже внеклеточно. Вокруг колонии многие ядра фибробластов и гистиоцитов инвазированы безноитиями. На фотографии они выделяются более яркой эозинофильной окраской и размерами. Окр. Гематоксилин – еозином.
Фото 26. Гистологический срез кожи 11 месячного бычка №1 при подострой стадии спонтанного безноитиоза. Показаны две одновременно формирующиеся тканевые цисты B.bеsnoiti в гидролизированной окружающей ткани. В одной из них, слева на фотографии, видно три ядерных псевдоцисты. В другой – две ядерных псевдоцисты и большая колония мерозоитов в гомогенной массе. Вокруг колонии видна уже мембрана, которая, с одной стороны, удерживает колонию компактно, с другой – отделяет колонию паразитов от гомогенной массы. Окраска железным гематоксилином и эозином.
Фото 27. Гистологический срез дермы бычка №1. Показано формирование цисты в гомогенизированной белковой массе. Хорошо видно пять инвазированных ядер. Из отдельных ядерных псевдоцист наблюдается выход мерозоитов в гомогенную массу. Вокруг формирующейся цисты резко выражена клеточная реакция за счёт моноцитов, гистиоцитов, фибробластов и небольшого количества сегментоядерных лейкоцитов. Окраска гематоксилин – эозином.
При окраске препаратов по Фёльгену хорошо видно, что не только в псевдоцистах ядра безноитий дают резко положительную реакцию, но и ядра внеклеточных паразитов формирующих колонию (фото 28).
Фото 28. Гистологический срез формирующейся цисты безноитий в дерме бычка №1. Показана резко положительная реакция Фёльгена паразитов делящихся в кариоплазме инвазированных ядер и безноитий находящихся в колонии. Окр. По Фёльгену, ув. Об. 40 х ок. 7.
Проведённое нами исследование гистологических препаратов, окрашенных по Браше (на РНК), суммарный белок бром феноловым синим, на нейтральные мукополисахариды по Мак - Манусу и Фёльгину на ДНК дают основание говорить, что по мере внеклеточного колониального размножения паразитов, в цитоплазме беноитий наблюдается снижение количества РНК и общего белка и увеличение количества гранул амилопектина (Бугаев, 2005). Обнаруженный факт свидетельствует о понижении метаболической активности паразитов находящихся во внеклеточной колонии. Однако для каких целей происходит такая смена метаболизма в колониальных паразитах пока остаётся загадкой, толи это подготовка к дальнейшему развитию и сохранению паразитов в организме жалящих насекомых, толи только для построения внутренней мембраны сложной оболочки цисты. В настоящее время ясно одно, что в результате сложного взаимодействия колонии безноитий с организмом хозяина, в дерме и других тканях животных образуются цисты размножения, с уникально устроенной оболочкой (Фото. 29). На фотографии показаны хорошо сформированные, типичные четыре цисты B.bеsnoiti. Все цисты отделены от окружающей соединительной ткани толстым, гомогенизированным слоем. Эозином этот слой окрашивается в светло - розовый цвет. Между гомогенизированным слоем и колонией паразитов хорошо выделяется средний, зернистый слой. Мы его называем питательным слоем или колониальной паразитофорной вакуолью. На фотографии он чётко обозначен в верхней левой цисте. По нашим наблюдениям он образуется за счёт гидролизированных клеток и тканей, находящихся вокруг колонии паразитов. В этом слое нередко обнаруживаются ядра, по каким - то причинам не подвергшиеся гидролизу и ядра – псевдоцисты неуспевшие «дозреть» до тех размеров, когда мерозоиты способны покинуть их. Судьба неинвазированных ядер однозначна, такие ядра по мере размножения мерозоитов и увелечения колонии сдавливаются между колонией паразитов и толстой гомогенной оболочкой и атрофируются. Здесь мы видем типичный пример атрофии от давления. Судьба ядер - псевдоцист двояка - в одном случае они также подвергаются атрофии, в другом - такие ядра – псевдоцисты выталкиваются колонией паразитов на перифирию и они дают начало образованию новой колонии – цисты (см. ниже).
Фото 29. Гистологический срез дермы коровы №4, при хроническом течении болезни. Показаны хорошо сформированные трёхслойные цисты B.bеsnoiti с множеством цистозоитов. В среднем слое видны атрофированные ядра клеток организма хозяина (показано стрелками). В левой верхней цисте хорошо виден средний питательный слой(колониальная паразитофорная вакуоль). В нижней левой цисте, в среднем слое видно ядро инвазированное паразитами(показано двумя стрелками). Окр. Гематоксилин – эозином.
ФОРМИРОВАНИЕ ОБОЛОЧЕК ЦИСТНОЙ СТЕНКИ B.bеsnoiti
А. ПРИ ВНЕКЛЕТОЧНОМ РАЗМНОЖЕНИИ И РАЗВИТИИ
В хорошо сформированной безноитиозной цисте, оболочка или стенка цисты состоит из двух слоёв разделённых двумя мембранами. Просматривая разные участки гистологических срезов кожи крупного рогатого скота при подостром и хроническом течении заболевания, нам удалось проследить, что по мере размножения и увеличения внеклеточной колонии паразитов в гомогенной массе, одновременно наблюдается и формирование оболочек цисты (Фото 33). На фотографии хорошо видна широкая зона гомогенизированных коллагеновых волокон дермы и всех ядер, находящихся в зоне гидролиза. При окраске гематоксилин – эозином в очаге формирования внеклеточной цисты можно видеть две чётко выделяющиеся по окраске гомогенизированные зоны. Светло - розовая зона – это будущий наружный гомогенный, толстый слой цистной оболочки; розовый слой с базофильным оттенком – это будущий зернистый или питательный слой. В последствии зернистый слой будет отделён от колонии паразитов и гомогенного слоя тонкими мембранами. Мембраны формируются, практически одновременно (фото 1, 2).
Фото 1. Гистологический срез кожи бычка №1. Хорошо виден выход мерозоитов из трёх ядерных псевдоцист и начало формирования мелкозернистого слоя, и двух мембран. На препарате питательный слой заметно отличается от наружного слоя своей базофильной окраской. Справа формирующейся цисты, хорошо видна наружная мембрана, отделяющая гомогенную массу (будущий толстый, гомогенный слой) от окружающей соединительной ткани. Окраска железным гематоксилином и эозином.
Фото 2. Гистологический срез дермы бычка №1. Подострое течение болезни. На фоторграфии, рядом с хорошо сформированной цистой (справа), в клеточном инфильтрате показана гомогенная масса, в которой видна большая колония паразитов, вокруг которой чётко обозначилась внутренняя мембрана. Внутри колонии видны разные стадии выхода из ядерных псевдоцист безноитий. Окраска железным гематоксилином и эозином.
По нашим наблюдениям, структура цистной оболочки B.bеsnoiti - это сложное «архитектурное сооружение» построенное колонией паразитов. Внутренний слой цистной оболочки формируется, в основном, за счёт строительного материала самих паразитов, который образуется при разрушении брадизоитов (Фото 3).
Фото 3. Гистологический срез дермы бычка №2. Показана периферическая часть колонии паразитов. Хорошо виден распад брадизоитов на эозинофильные и базофильные гранулы. Окр. Гематоксилин – еозином.
При окраске препаратов по Мак – Манусу хорошо видно, что при распаде брадизоитов выделяются гранулы, дающие положительную реакцию на нейтральные мукополисахариды (Фото 4).
Фото 4. Гистологический срез кожи бычка №1, подострое течение. Показан участок начала формирования внутренней мембраны цистной оболочки. Хорошо виден распад брадизоитов на периферии колонии и высвобождение при этом гранул амилопектина (нейтральных мукополисахаридов). Окраска по Мак – Манусу.
Просматривая несколько полей зрения микроскопа можно проследить, как часть гранул амилопектина идёт на построение внутренней мембраны оболочки цисты, а большая часть этих гранул учавствуют в формировании зернистого слоя оболочки. Внутренняя мембрана отделяет колонию паразитов от среднего зернистого(питательного) слоя. Образовавшись, эта мембрана постоянно присутствует в цистах во всех органах и тканях организма хозяина. Даже в тех органах и случаях, когда отсутствует зернистый и гомогенный слой (см. ниже). Одновременно с формированием внутренней мембраны, прослеживается формирование и наружной мембраны, которая отделяет зернистый (питательный) слой от толстого, гомогенного слоя (Фото 5).
Фото 5. Гистологический срез формирующейся цисты непосредственно под эпидермисом кожи бычка №2. Хорошо виден средний зернистый слой и наружный, толстый гомогенный слой. В отдельных местах фотографии чётко видна внутренняя и наружная мембраны питательного слоя. Окр. Гематокселин – эозином.
В 2003 году в Интернет появилась работа, выполненная J.P.Dubey and all. под названием «Ultrastructure of Besnoitia besnoiti Tissue Cysts and Bradyzoites”. На опупликованных фотографиях ультратонкого строения брадизоитов безноитий крупного рогатого скота, между паразитами хорошо видны электронно - плотные структуры и гранулы амилопектина как в цитоплазме паразитов, так и между ними, что полностью согласуется с нашими данными о формировании тканевых цист безноитий полученными с помощью светового микроскопа.
Фото J.P.Dubey and all. На фотографии видны внутрицистные паразиты (брадизоиты) Besnoitia besnoiti. Важно отметить наличие между брадизизоитами большого количества электронно платных гранул и гранул амилопектина, как в цитоплазме паразитов, так и между ними.
Таким образом, достоверно прослеживается, что средний (мелкозернистый) слой, толстый (гомогенный) слой и мембрана между наружным, гомогенным слоем и средним зернистым, формируются за счёт гомогенизированной массы. Макроорганизм при этом «строительстве» принимает пассивное участие, только как поставщик строительного материала. Создаётся такое впечатление, что в колонии безноитий существует, какая то иерархия и специализация, «разделение труда». Паразиты находящие в центре колонии продолжают размножаться, а те которые находятся на периферии, активно участвуют в построении внутренней мембраны оболочки цисты «жертвуя» собой ради спасения колонии безноитий.
Основываясь на гистохимических исследованиях среднего слоя, можно предположить, что он служит своеобразной колониальной паразитофорной вакуолью, в котором с самого начала формирования цисты концентрируются питательные вещества необходимые для дальнейшего размножения и развития внеклеточной колонии паразитов. Нами в мелкозернистом слое выявлено большое количество РНК, общего белка и нейтральных мукополисахаридов. Наружный, толстый слой, вначале образования цисты, так же содержит большое количество пиронинофильного материала (РНК), общего белка и полисахаридов. Но затем по мере формирования цисты интенсивность этих реакций заметно понижается. По – видимому, нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды, каким то образом диффундируют в мелкозернистый слой (фото 6).
Фото 6. Гистологический срез зрелой, хорошо сформировавшейся цисты безноитий коровы. Хорошо видна внутренняя мембрана (показано стрелкой), средний, мелкозернистый слой, содержащий большое количество Шик – положительных гранул и толстый гомогенный слой, в котором так же выявляется нейтральные мукополисахариды. Окраска по Мак – Манусу.
Представление о том, что толстая оболочка цисты формируется только из соединительной ткани, сложилось, по – видимому, в связи с тем, что в отдельных участках препаратов можно чётко видеть, как пучки соединительной ткани подвергаются гидролизу и превращаются в наружный, гомогенный слой оболочки цисты (Фото 7).
Фото 7. Гистологический срез участка дермы коровы, хроническое течение безноитиоза. Флюоресцентная микроскопия. Показана часть оболочки зрелой цисты B.bеsnoiti и окружающая цисту соединительная ткань. Хорошо видно, как пучок соединительной ткани входит в наружный слой оболочки и подвергается гомогенизации (гидролизу). Наружный слой цистной оболочки, по химическому составу, по – видимому, не однороден и поэтому флюоресцирует разным светом. Препарат обработан акридиновым оранжевым.
Наши исследования также показали, что наружная оболочка цисты формируется из гомогенной массы. Однако, она образуется не только при гидролизе волокон соединительной ткани, но и других тканей, включая и их ядра. При этом необходимо отметить, что инвазированные ядра клеток организма хозяина, а вернее ядерные псевдоцисты, не подвергаются гидролизу. С чем это связано, пока, не известно. Можно только предположить, что по мере формирования ядерных псевдоцист, со стороны ядерной оболочки происходят глубокие структурные изменения, которые, в конечном счёте, защищают ядерную псевдоцисту от гидролиза. В то время, как окружающая ткань, независимо какая - нервная, мышечная, соединительная, ретикулярная, железистая, эпителиальная и их ядра подвергаются гомогенизации (гидролизу). (Фото 8).
Фото 8. Гистологический срез многослойного плоского эпителия кожи бычка №1. Вокруг ядерной псевдоцисты безноитий видна зона гомогенизации капилляров и их эндотелия, а также клеток росткового, шиповатого и зернистого слоёв эпидермиса. Окр. Железным гематоксилином и эозином.
Ядерные псевдоцисты, безноитий которых не успели выйти в гомогенную массу, по мере формирования оболочек цист, каким – то образом, выталкиваются на периферию гомогенной массы. Здесь они «дорастают» до зрелых, полноценных псевдоцист и дают начало развитию новым цистам. Этот процесс напоминает отдалённое сходство с почкованием, имеющим место у простейших других классов и отрядов. Поэтому некоторыми исследователями этот процесс описывается, как почкование протоплазматических тел безноитий (Фото 9 -10). Хотя этот процесс никакого отношения к почкованию протоплазматических тел паразитов не имеет. Поскольку «отпочковывается» не протоплазма паразитов, а гомогенная, слизистая масса, образовавшаяся в результате гидролиза тканей окружающих колонию паразитов.
Фото 9. Гистологический срез кожи бычка №1, подострая фаза болезни. Показана группа цист безноитий непосредственно под эпидермисом. Хорошо видно так называемое, «отпочковывание протоплазматических тел» Окраска железным гематоксилином и эозином.
Фото 10. Гистологический срез дермы бычка №2. Показано формирование новой цисты в «отпочковавшейся» колонии безноитий. Видна внеклеточная колония паразитов в гомогенной массе. Окраска железным гематоксилином и эозином.
Среди ядерных псевдоцист, в гомогенной массе встречаются и неинвазированные ядра. Такие ядра, как правило, гидролизуются и превращаются в бесструктурную гомогенную массу. Часть же из них выталкивается колонией паразитов в средний, зернистый слой. И по мере созревания цисты прижимаются к толстому гомогенному слою и атрофируются (Фото 11).
Фото 11. Гистологический срез дермы кожи коровы при хроническом течении безноитиоза. Показана зрелая циста, содержащая большое количество брадизоитов . В среднем, зернистом слое, видны сдавленные ядра неинвазированных клеток – хозяина. Окр. Железным гематоксилином и эозином.
Таков наиболее часто встречаемый способ образования тканевых цист у B.bеsnoiti, который мы наблюдали в дерме крупного рогатого скота. В наших случаях, в хорошо сформированных цистах, мы видим две оболочки, разделённых двумя мембранами. Внутренняя мембрана, отделяющая колонию паразитов от зернистого слоя, является производным самих паразитов и материала из гомогенезированной массы. Средний, мелкозернистый слой (колониальная паразитофорная вакуоль) формируется из гидролизованных тканей организма хозяина и частично из материала распадающихся мерозоитов (материала, по – видимому, не пошедшего на формирование внутренней мембраны). Наружная мембрана и толстый гомогенный слой полностью формируются из гомогенной, слизистой массы образующейся при гидролизе тканей окружающих колонию паразитов. Следует особо подчеркнуть, что наружная, толстая оболочка образуется не из волокон соединительной ткани, как имеет место, например, при формировании паразитарных или туберкулёзных гранулём. Она формируется из гомогенной массы, образовавшейся в результате гидролиза окружающей ткани, в том числе и соединительной ткани.
Нами прослежена динамика метаболизма гликогена (амилопектина), РНК и общего белка на разных стадиях развития и размножения безноитий. Проведённые нами цитохимические и люменистентно микроскопические исследования показали, что безноитии, в фазу пролиферации, являются весьма метаболически активными паразитами. Так, например, быстро размножающиеся трофозоиты имеют в цитоплазме высокое содержание РНК и общего белка, тогда как в цитоплазме брадизоитов интенсивность этих реакций постепенно ослабевает. Что касается мукополисахаридов (амилопектина), то в цитоплазме трофозоитов они встречаются в виде единичных, мелких гранул, тогда как в брадизоита гранулы амилопектина заполняют, практически, всю цитоплазму.
Представляет особвый интерес своеобразная «специализация» брадизоитов в формирующихся цистах. Создаётся такое впечатление, что паразиты, расположенные в центре колонии специализируются только на размножении. О чём свидетельствует интенсивность окраски их цитоплазмы на РНК и общие белки, а так же более интенсивное окрашивание ядер брадизоитов по Фёльгену на ДНК. Брадизоиты расположенные на периферии колонии, больше содержат нейтральных мукополисахаридов. Нами достоверно прослежено, что цитоплазма части паразитов, расположенных на периферии колонии, разрушается. При этом высвобождается накопившейся в цитоплазме паразита амілопектин, который идёт на построение внутреннего слоя цистной оболочки.
При цитохимическом изучении формирования цист безноитий было прослежено постепенное увеличение содержания амилопектина в цитоплазме внутрицистных брадизоитов. Возникает естественный вопрос, каким образом и откуда поступает амилопектин в цитоплазму безноитий?
Б.ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ЦИСТ B.bеsnoiti
ПРИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОМ ИХ РАЗМНОЖЕНИИ И РАЗВИТИИ
Наряду с внеклеточным формированием цист B.bеsnoiti, нами прослежен второй способ образования цист из ядерных псевдоцист. Этот способ характеризуется тем, что по мере размножения паразитов в кариоплазме инвазированной клетки, ядерная оболочка не разрывается, а реорганизуется во внутреннию мембрану колонии паразитов (цисты). Цитоплазма инвазированной клетки, вначале, незначительно гипертрофируется, а затем вместе с окружающей тканью подвергается гидролизу и превращается в гомогенную, слизистую массу (Фото 12, 13)
Фото 12. Гистологический срез дермы бычка №1, подострая фаза болезни. Показана колония безноитий, удерживаемая ядерной оболочкой. На фоне гомогенной бесструктурной массы контуры цитоплазмы инвазированной клетки ещё хорошо видны, в виде узкого эозинофильного ободка. Окр. железным гематоксилином и еозином.
Фото 13. Гистологический срез дермы бычка № 2. Показана ядерная псевдоциста с частично гидролизированной цитоплазмой . Ядерная оболочка сохранена и удерживает колонию паразитов. Окр. Железным гематоксилином и эозином.
Этот способ образования тканевых цист только условно можно назвать внутриклеточным. Поскольку по мере роста колонии в кариоплазме, цитоплазма инвазированной клетки гидролизируется, а ядерная оболочка претерпевает сложнейшие изменения и растягивается до огромных размеров, превращаясь в мембрану отделяющюю колонию паразитов от гомогенезированной массы. По мере увеличения числа паразитов в колонии, вокруг ядерной псевдоцисты отмечается формирование мелкозернистого слоя (колониальной паразитофорной вакуоли). Образование зернистого слоя идёт по такому же плану, как и при внеклеточном формировании цист, с той лишь разницей, что внутренней мембраной отделяющей колонию паразитов от зернистого слоя является морфологически изменённая ядерная оболочка (Фото 14, 15).
Фото 14. Гистологический срез эпидермиса бычка №1. Вокруг внутриядерной колонии паразитов хорошо видна морфологически изменённая ядерная мембрана, средний зернистый слой, наружная мебрана и толстый гомогенный слой. В зернистом слое видно большое количество базофильных гранул. Окраска железным гематоксилином и эозином.
Фото 15. Тот же участок препарата, только сфотографированный на чёрно - белую плёнку. На снимке хорошо видны все слои будущей цисты, особенно хорошо просматривается средний, зернистый слой (колониальная паразитофорная вауоль). Окраска железным гематоксилином и эозином.
Таким образом, наши наблюдения по внутриклеточному формированию цист B.bеsnoiti, в какой – то мере, согласуется с исследованиями J.P.Dubey and all. (2003), которые при электронно – микроскопическом изучении тканевых цист Besnoitia besnoiti описали формирование зернистого слоя вокруг колонии безноитий (брадизоитов). Однако, авторы считают, что паразитофорная вакуоль образуется в цитоплазме инвазированной клетке, мы же на уровне светооптических исследований никогда не видели образования цист B.bеsnoiti внутри цитоплазмы клетки хозяина, равным образом как и не наблюдали цитоплазматических псевдоцист. В любом случае, приведённые J.P.Dubey and all.(2003) в статье « Ultrastructure of Besnoitia besnoiti tissue cests and bradyzoites» фотографии, полученные с помощью электронного микроскопа представляют большой интерес и согласуются с нашими исследованиями в плане формирования зернистого слоя и наружной мембраны(PVM) отделяющей зернистый слой от цитоплазмы инвазированной клетки. Однако на фотографии, приведенной в статье не видна внутренняя мембрана, отделяющая зернистый слой от колонии паразитов, которая в гистологических срезх приготовленных из хорошо сформированных цист, всегда присутствует и чётко контурирована. Возможно, на снимке представлена молодая ещё формирующая циста. Несмотря на это, огромная ценность этой фотографии состоит в том, что мы впервые увидели на электронно - микроскопическом уровне формирование паразитофорной вакуоли вокруг огромной колонии паразитов B.bеsnoiti.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мы приводим фотографию ультратонкого строения цисты Besnoitia besnoiti из работы J.P.Dubey and all.(2003) с комментарием авторов в оригенале. Наш комментарий этой фотографии в тексте.
Fig. 2. Transmission electron micrograph of tissue cyst wall of Besnoitia besnoiti. The parasitophorous vacuolar membrane (PVM) is lined by a granular layer (GL), and a longitudinally cut bradyzoite is butted against the granular layer. Note numerous micronemes (MN), a few rhoptries (R), a nucleus (N), and amylopectin granules (AG) and host cell (HC). Vacuolated structures and degenerated parasites (arrows) are present in the parasitophorous vacuole. There is a slight deposit of subpellicular granular material (arrowheads) at the conoidal (C) end.
ОБРАЗОВАНИЕ МНОГОКАМЕРНЫХ ЦИСТ B.bеsnoiti
Обычно зрелые цисты безноитий не септированы и имеют довольно постоянную круглую форму и размер около 300 мк. в диаметре. Однако, в хроническую фазу болезни, при интенсивной инвазии дермы паразитами, нередко можно видеть цисты с двумя или тремя камерами (септами). Структура таких цист отличается от обычных цист тем, что разделены они на камеры мембранами, между которыми хорошо просматривается, иногда очень широкий мелкозернистый (питательный) слой. Толстый, гомогенный слой у таких цист хорошо сформирован и является общими для нескольких септ - камер (Фото 16).
Септы у B.bеsnoiti образуются, когда в гомогенной массе рядом развиваются две или три ядерных псевдоцисты, брадизоиты которых не выходят в гомогенную массу. В результате такого совместного, параллельного развития псевдоцист, вокруг них образуется общий толстый слой, а вокруг каждой псевдоцисты формируется зернистый, питательный слой(Фото 17, 18, 19). Внутренними мембранами, отделяющими колонии паразитов от зернистого слоя, являются мрфологически изменённые ядерные оболочки инвазированных когда - то клеток организма хозяина.
Фото.16. Гистологический срез дермы коровы при хроническом течении безноитиоза. Видна трёхкамерная циста, окружённая общей толстой оболочкой. Наряду с хорошо развитыми септами, встречаются микроцисты с плотно упакованным зернистым, базофильным содержимым (Показано стрелкой). Окраска железным гематоксилином и эозином.
Фото 17. Гистологический срез дермы коровы. На фотографии видна двукамерная циста, окружённая общей гомогенной оболочкой. Флюоресцентная микроскопия. Препарат обработан акридиновым оранжевым.
Фото 18. Гистологический срез дермы коровы с двукамерной цистой. Флюоресцентная микроскопия. Препарат обработан акридиновым оранжевым. Показан широкий питательный слой, флюоресцирующий тёмно – оранжевым светом, что свидетельствует о наличии в нём большого количества РНК и нейтральных мукополисахаридов. Общая наружная оболочка флюоресцирует светло - зелёным светом.
В отдельных многокамерных цистах, наряду с развивающимися псевдоцистами, можно видеть и ядра неинвазированных клеток оказавшихся в общей гомогенной оболочке (Фото 19). Судьбу таких ядер проследить нам не удалось. По – видимому, в дальнейшем, при увеличении септ, они атрофируются, будучи заключёнными между оболочками септ и толстым гомогенным слоем.
Фото 19. Гистологический срез двухкамерной цисты B.bеsnoiti. Показана перегородка между септами, состоящая из мелкозернистого (питательного слоя). Между септами и толстой гомогенной оболочкой видна группа ядер клеток воспалительного инфильтрата. Окр. По Мак – Манусу.
ГИСТОХИМИЯ ГОМОГЕННОЙ МАССЫ ОБРАЗУЮЩЕЙСЯ ВОКРУГ
ЯДЕРНЫХ ПСЕВДОЦИСТ И КОЛОНИЙ B.bеsnoiti
Данные в отношении структуры и биохимии гомогенной массы, обнаруживаемой вокруг цист B.bеsnoiti в литературе, практически, отсутствуют. А те немногие публикации, которые мы нашли в доступной нам литературе, крайне противоречивы. В связи с этим, мы не будем анализировать эти работы, поскольку они были опубликованы в 50 – годы прошлого столетия и уже стали историей. Учитывая такую ситуацию, мы провели гистохимическое и флуоресцентно - микроскопическое исследование гомогенизированной массы на разных стадиях подострого и хронического течения безноитиоза крупного рогатого скота. Исследования показали, что гомогенная масса - это не дистрофическая масса подобная фибриноидно перерожденной (мёртвой) ткани или ценкеровского некроза. Это живой, гидролизированный субстрат, подобный слизистой эмбриональной ткани, содержащий высокий уровень РНК, общего белка, мукополисахаридов и по – видимому, других органических и неорганических веществ необходимых паразитам. Создаётся такое впечатление, что безноитии, на какой – то стадии своего развития, синтезируют фермент, подобный саркоцистину, который способен превращать окружающие клетки и ткани в эмбриональную слизистую ткань и из неё, затем ассимилировать необходимые питательные вещества для колониального своего развития и размножения (Фото 20 - 30).
ПРИМЕЧАНИЕ: При обработке гистологических препаратов акридиновым оранжевым, ярко оранжевым светом флуоресцирует РНК в цитоплазме паразитов и клетках воспалительного пролиферата. Ядра клеток, соединительная ткань и амилопектин флуоресцируют зеленым светом.
Фото 20. Гистологический срез дермы тёлки, подострое течение безноитиоза. Рядом с хорошо сформированной цистой, показана гомогенная масса, дающая резко положительную реакцию на нейтральные мукополисахариды. Окраска по Мак –– Манусу.
Фото 21. Гистологический срез дермы бычка №1, при подостром безноитиозе. Окраска препарата по Браше. Хорошо видна центральная часть гомогенезированной массы дающая резко положительную реакцию на РНК.
Фото 22. Гистологический срез дермы телки №3. Показана зарождающаяся циста. Гомогенная масса даёт положительную реакцию Браше на РНК. В центре гомогенной массы видно три ядерных псевдоцисты. Ядра паразитов окрашиваются базофильно. Окр. По Браше.
Фото 23. Серийный срез предыдущего блока. Люминисцетная микроскопия. Окраска препарата акридиновым оранжевым. Видно тёмно оранжевое свечение гомогенной массы и слабо – зелёное свечение ядер мерозоитов (гомогенная масса содержащая большое количество мукополисахаридов флюоесцирует тёмно - зелёным светом).
Фото 24. Гистологический срез дермы бычка №2. Окраска препарата по Мак – Манусу. Показано распределение нейтральных мукополисахаридов в дерме и зарождающихся цистах. Мукополисахариды окрашиваются в разные оттенки розового цвета.
Фото 25. Гистологический срез кожи бычка №1. Видна резко положительная реакция на РНК гомогенной слизистой массы вокруг формирующейся цисты после обработки препарата РНКазой. В цитоплазме брадизоитов находящихся внутри цисты и клетках воспалительного инфильтрата пиронинофелия, практически отсутствует. Окр. по Браше с обработкой препарата РНКазой.
Фото 26. Гистологический срез дермы бычка №2. Обработка препарата акридиновым - оранжевым. Показана флуоресценция зарождающейся цисты. Хорошо видно, что размножающиеся мерозоиты в колонии флюоресцируют ярко оранжевым светом, что свидетельствует о наличии в их цитоплазме увеличенного количества РНК. Зернистый, питательный слой чётко контурирован и в нём так же видны гранулы флюоресцирующиеся оранжевым светом.
Фото 27. Гистологический срез кожи бычка №1. Общий вид ещё формирующейся цисты и окружающей ткани при флюоресцентной микроскопии. Обработка препарата акридиновым оранжевым. Хорошо видно ярко оранжевое свечение клеток воспалительного пролиферата и внутреннего , зернистого слоя молодой цисты, что свидетельствует о содержании в них увеличенного количества РНК. Толстый, гомогенный слой флуоресцирует тёмно - оранжевым светом, что свидетельствует о содержании в нём не только РНК, но и значительного количества нейтральных мукополисахаридов. Цитоплазма отдельных паразитов в цисте флуоресцируют жёлто – зелёным светом (это флюоресценция покоящихся брадизоитов, содержащих в своей цитоплазме увеличенное количество амилопектина). Среди паразитов с таким свечением, в центре цисты видны брадизоиты с ярко оранжевым свечением (это делящиеся паразиты с повышенным содержанием в их цитоплазме РНК). Соединительная ткань, окружающая цисту безноитий флуоресцирует тёмно зелёным светом. Об.10 х ок.10.
Фото 28. Гистологический срез дермы коровы, хроническое течение безноитиоза. Показана структура зрелой, хорошо сформированной цисты и окружающей ткани при флюоресцентной микроскопии. Препарат обработан акридиновым оранжевым. Все брадизоиты внутри цисты флюоресцируют зелёным светом, внутренний, питательный слой флуоресцирует светло – оранжевым слоем, что свидетельствует о наличии в нём ещё небольшого количества РНК. Наружный, толстый слой флюоресцирует тёмно - зелёным светом. На фотографии хорошо видно как пучок соединительной ткани входит в гомогенную массу и растворяется в ней.
Фото 29. Общий вид гистологического среза дермы коровы при хроническом течении болезни. Препарат окрашен по Мак – Манусу. Хорошо видна резко положительная реакция на нейтральные мукополисахариды гомогенной массы и оболочек цист.
Фото 30. Гистологический срез дермы бычка №1, через год наблюдений, хроническое течение болезни. Показан общий вид гистологического среза основы кожи и эпидермиса при окраске препарата по Браше. Хорошо видна разная степень интенсивности окраски стенок цист и брадизоитов на РНК.
Таким образом, проведённые нами гистохимические и люменисцентно – микроскопические исследования проб дермы животных, взятых на протяжении годичного исследования, показали, что гомогенная (слизистая) масса по своему биохимическому составу сходна с эмбриональной слизистой тканью и вполне может служить субстанцией для дальнейшего питания колонии паразитов. Учитывая гистохимическую структуру гомогенизированной массы, можно предположить, что она по своему назначению соответствует паразитофорной вакуоле для внутриклеточных паразитов. Разница заключается лишь в том, что внутриклеточная паразитофорная вакуоль формируется одним паразитом находящимся внутри клетки хозяина. И гидролизу подвергаются структуры и питательные вещества, находящиеся в цитоплазме инвазированной клетки. Паразитофорная вакуоль является местом концентрации низкомолекулярных блоков клетки хозяина, из которых затем паразит синтезирует свои собственные нуклеиновые кислоты, белки углеводы и другие биологические вещества, необходимые для паразитов. Гомогенная же масса образуется вокруг ядерных псевдоцист B.bеsnoiti за счёт гидролиза всех тканей и клеток, находящихся вокруг них. Происходит как бы подготовка паразитами «окружающей среды» для дальнейшего внеклеточного своего развития и размножения. Вокруг внеклеточной колонии, паразиты из гидролизированных клеток и тканей организма хозяина, формируют зернистый слой, в котором концентрируются питательные вещества для колонии паразитов. По своему назначению этот слой подобен внутриклеточной паразитофорной вакуоли – это концентрация низкомолекулярных строительных блоков для синтеза уже своих нуклеиновых кислот и других органических и неорганических веществ необходимых колонии паразитов.
НЕКОТОРЫЕ ВОПРОСЫ РАЗМНОЖЕНИЯ B.besnoiti
Работ посвящённых специально делению и размножению B.besnoiti в организме крупного рогатого скота в доступной литературе мы не нашли. Имеются лишь две обзорных публикации, где попутно описывается деление и размножение B.besnoiti непосредственно в организме животных. Это работа Френкель (Frenkel, 1953) и Полс( Pols, 1954, 1960). Авторы их считают, что размножение B.bеsnoiti происходит путём повторного бинарного деления в две фазы. Первая фаза протекает в цитоплазме белых элементов крови - моноцитах и нейтрофилах, в которых паразиты делятся путём эндодиогении до разрыва инвазированной клетки. Затем, эндозоиты покинувшие разрушенную клетку хозяина внедряются в новые клетки, теперь уже в цитоплазму гистиоцитов и дают начало второй фазе развития и размножения. Авторы отмечают, что в цитоплазме инвазированных гистиоцитов безноитии делятся путём эндодиогении и полиэндодиогении. В результате такого деления в цитоплазме гистиоцита образуется большая колония паразитов, которая затем формирует цисту с прочной оболочкой.
Данные Френкель (Frenkel, 1953) и Полс( Pols, 1954, 1960) были подтверждены при более детальном изучении размножения у Besnoitia jellisoni (возбудитель безноитиоза грызунов) в культуре клеток. Так Г.Т.Акиншина и Ж.М. Доби(1969), изучая безноитий грызунов в культуре клеток наблюдали внутриядерное деление B. jellisoni путём эндодиогении и множественного деления. Несколько лет позже J. Senaud и др.(1974) описали эндодиогению и полиэндодиогению у B. jellisoni при экспериментальном заражении мышей.
Полученные нами данные при изучении биопсийного материала кожи крупного рогатого скота, согласуются с данными Френкель (1969) и Полс (1960) о размножении B.besnoiti в две фазы. Первая фаза, фаза пролифирации протекает в цитоплазме и ядрах белых элементов крови (Фото 31,32).
Фото 31. Гистологический срез сосочкового слоя дермы бычка №1, подострая фаза болезни. В просвете вены показано резко увеличенное инвазированное ядро, по – видимому, моноцита. Хорошо виден момент множественного деления паразитов. Гомогенизации окружающей ткани не наблюдается. Окр. железным гематоксилином и эозином.
Фото 32. Гистологический срез дермы бычка №1. В просвете вены видна группа свободных паразитов образовавшихся после распада ядерной оболочки моноцита. Гомогенизации окружающей ткани не наблюдается. Окр. железным гематоксилином и еозином.
При исследовании кожи животных в подострую фазу заболевания, мы также как Френкель (1969) и Полс (1960) обнаруживали гигантские клетки с размножающимися паразитами (Фото 33, 34, 35).
Фото 33. Гистологический срез дермы бычка№1. Подострая фаза течения безноитиоза. Среди волокон соединительной ткани видно чётко контурированная клетка, по - видимому, гистиоцит с размножающимися паразитами в ядре и цитоплазме. Вокруг внутриядерных мерозоитов хорошо видна ядерная мембрана, отделяющая паразитов от цитоплазмы, в которой видны паразиты. Окраска гематоксилин – эозином.
Фото 34. Гистологический срез дермы бычка №1. Показаны гигантских размеров клетки, в цитоплазме которых видны размножающиеся паразиты. Окр. Гематоксилин – еозином.
Фото 35. Гистологический срез кожи бычка №2, подостроя фаза течения безноитиоза. Видна группа делящихся паразитов в цитоплазме гигантской клетки. Окр. Гематоксилин – эозином. Ув. Об.100 х Ок. 15. Однако таких клеток было небольшое количество. По большому счёту такие образования трудно даже назвать клетками. Нам не удалось проследить судьбу этих образований. Можно допустить, что это одна из завершающих стадий внутриклеточного размножения безноитий, предшествующая внутриядерному и внеклеточному колониальному размножению B.besnoiti.
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОЖИ
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПРИ БЕЗНОИТИОЗЕ
В гистологических срезах кожи взятой у животных в подострую фазу течения болезни обнаруживались колонии безноитий находящие на разных стадиях образования цист. Вокруг формирующихся цист, по ходу кровеносных и лимфатических сосудов можно было видеть большое количество клеточных пролифератов, состоящих в основном из мононуклеаров - лимфоцитов и моноцитов крови, а так же из гистиоцитов и фибробластов (Фото 1 - 2).
Фото 1. Гистологический срез дермы бычка №1. Показан общий вид реакции организма хозяина на присутствие в основе кожи формирующихся цист безноиний. Хорошо видна диффузная пролиферация клеток по ходу кровеносных и лимфатических сосудов. Окр. Железным гематоксилином и эозином.
Фото 2. Гистологический срез кожи бычка взятой в подострую фазу течения безноитиоза. Показана формирующиеся циста, вокруг которой виден, выраженный клеточный пролиферат состоящий из мононуклеаров. Часть ядер расположенных по периферии колонии инвазированы безноитиями. Окр. Железным гематоксилином и эозином.
Эндотелий вен и капилляров набухший и пролиферирует в просвет сосудов. Нередко просветы мелких вен заполнены большим количеством пролиферирующегося эндотелия (Фото 3). При окраске парепаратов по Браше, в цитоплазме клеток воспалительного инфильтрата выявляется увеличенное количество РНК. При люменесцентной микроскопии цитоплазма клеток воспалительного пролиферата флюоресцирует ярко оранжевым светом (Фото 4).
Фото 3. Гистологический срез сосочкового слоя бычка при подостром безноитиозе. Показан общий вид изменений в сосочковом слое дермы. Видно большое количество мононуклеаров в соединительной ткани и пролифирация эндотелия вен и капилляров. Просветы отдельных вен заполнены большим количеством пролиферирующего эндотелия. Окр.Гематоксилином и еозином.
Фото 4. Гистологический срез кожи бычка, подострое течение безноитиоза. Препарат обработан акридиновым оранжевым. Клетки воспалительного инфильтрата флюоресцируют оранжевым светом, что свидетельствует о содержании в их цитоплазме большого количества РНК. Таким же светом флуоресцирует и средний (питательный слой) цистной оболочки. На снимке хорошо видна внутренняя мембрана оболочки цисты.
В гистологических срезах кожи взятой у животных в подострую и хроническую фазу течения болезни обнаруживалось большое количество хорошо сформированных цист безноитий. Многие из них располагались под самым эпидермисом. Местами эпидермис от давления цист настолько был атрофирован, что представлялся в виде истончённого ободка состоящего из двух или трёх рядов клеток. Такое расположение цист безноитий непосредственно под атрофированным эпидермисом, безсомнения, способствует трансмиссии паразитов жалящими насекомыми (фото 5,6).
Фото 5. Гистологический срез дермы тёлки, подострое течение. Показаны хорошо сформированные цисты безноитий непосредственно под истончённым эпидермисом. Окр. Гематоксилин – эозином.
Фото 6. Гистологический срез дермы коровы. Показана хорошо сформированная циста безноитий расположенная непосредственно под эпидермисом. Окр. гематоксилин – эозином.
В хроническую фазу течения болезни в дерме обнаруживается большое количество цист безноитий. При окраске препаратов обычными красителями включая гематоксилин - эозином, трудно бывает заметить какие – либо изменения со стороны цист. Однако при окраске препаратов по Браше (на РНК) в отдельных цистах, чётко прослеживается уменьшение РНК положительного материала в зернистом слое оболочки(Фото 7).
Фото 7. Гистологический срез основы кожи коровы при хроническом течении болезни. Показана разная степень интенсивности окраски оболочек цист по Браше на РНК.
По мере уменьшения содержания РНК в зернистом слое, отмечается утончение оболочки цисты, брадизоиты в цисте подвергаются дистрофии и погибают. Морфологически это проявляется тем, что границы между паразитами выявляюся не чётко, и они интенсивно воспринимают базофильные краски. Просматривая несколько участков среза, можно проследить как содержимое цисты, вместе с внутренней мембраной, уменьшается в размере, в то время как остальные слои цистной оболочки ещё сохраняются. У таких цист можно наблюдать, как толстая цистная стенка лизируется и клетки воспалительного инфильтрата начинают проникать внутрь цисты (Фото 8).
Фото 8. Гистологический срез дермы коровы. Показана деструкция оболочки цисты и проникновение клеток воспалительного инфильтрата внутрь цисты. На фотографии хорошо видна внутренняя мембрана оболочки цисты удерживающая колонию погибающих паразитов. Зернистый слой представлен в виде тонкого базофильного ободка. Окр. Гематоксилин – эозином.
Нередко вокруг погибающих цист можно видеть большие клеточные пролифераты состоящие преимущественно из сегментоядерных лейкоцитов и небольшого количества лимфоцитов и гистиоцитов (Фото 9).
Фото 9. Гистологический срез дермы коровы при хроническом течении заболевания. Наряду с хорошо сформированными цистами видна погибающая циста, окружённая большим количеством клеток организма хозяина. Окр. Гематоксилин – еозином.
При окраске препаратов по Браше оболочки таких цист дают слабую реакцию на тейтральные мукополисахариды, общие белки и в них полностью отсутствует РНК (Фото 10).
Фото10. Гистологический срез погибающей цисты, вокруг которой можно видеть большое количество клеток воспалительного инфильтрата. Показано полное отсутствие РНК в стенке цисты. Сама циста незначительно деформирована, а стенка местами инфильтрирована сегментоядерными лейкоцитами. Окраска по Браше.
Б.П. Всеволодов (1959) на месте погибающих цист наблюдал образование типичных паразитарных гранулём. Нами при интенсивной инвазии дермы паразитами прослежена гибель цист безноитий в гомогенной слизистой массе (Фото 11).
Фото 11. Участок сильно поражённой кожи коровы. Под эпидермисом, на большом участке препарата видна сплошная гомогенная слизистая масса, в которой погибают цисты безноитий. Окраска железным гематоксилином и еозином.
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В СЕМЕННИКАХ
При безноитиозе крупного рогатого скота у быков производителей часто поражаются семенники. Причём поражается не только кожа семенников, но и их паренхима. (Фото 12)
Фото 12. Поражение семенников у быка производителя. Фото взято из работы Faculdade de Medicina Veterinária.
Нами, через год после наблюдений за животными, была произведена кастрация двух бычков и проведено гистологическое исследование кожи семенников, и самих половых желёз. В гистологических срезах кожи были обнаружены хорошо сформированные цисты безноитий, морфологически идентичные цистам в других участках кожи животных (Фото 13).
Фото 13. Гистологический срез кожи семенников бычка №1 взятой в 18 месячном возрасте и через год начала наших исследований. Хронический безноитиоз. В дерме показаны классические, хорошо сформированные цисты безноитий с толстыми стенками. Окр. Гематоксилин – еозином.
В семенниках и семенных канатиках так же можно было видеть значительное количество резко очерченных округлых цист. Хотя цисты в семенниках имели общий план строения с кожными цистами, однако они заметно отличались от таковых описанных нами выше. Отличие проявлялось тем, что стенки цист были тоньше и не имели чётко контурированного зернистого слоя (Колониальной паразитофорной вакуоли). Хорошо просматривалась лишь внутренняя мембрана, удерживающая колонию паразитов. Наружный слой оболочки цист представлялся каким – то рыхлым и состоял исключительно из гомогенезированных коллагеновых волокон. И самое главное, вокруг цист не было клеточных скоплений, которые всегда сопровождали образование цист в дерме (Фото 14). Клеточные пролифераты, если и встречались, то крайне редко и в них было немного клеток воспалительного инфильтрата
.
Фото 14. Гистологический срез семенного канатика бычка №1. Показана группа цист безноитий в строме семенного канатика. Хорошо видна атрофия эпителия канатика и практически, выход цисты в просвет канальца. Оболочки цист рыхлые и имеют незначительный слой гомогенной наружной оболочки. Клеточная реакция вокруг цист отсутствует. Окраска по Ван – Гизон.
Соединительная ткань семенников была незначительно отёчная, однако хорошо сохранена, положительно окрашивалася по Ван – Гизону. Общая реакция тканей семенника на присутствие цист безноитий была слабо выражена. Она проявлялась в виде незначительного гидролиза соединительной ткани вокруг цист и атрофическими изменениями в семенных канатиках. Несмотря на это, хорошо прослеживается, что цисты безноитий обнаруживаемые в семенниках не занесены из других органов и тканей. На что указывает их тесная связь с волокнами соединительной ткани и редкие очаги зарождающихся новых цист. При зарождении цист можно было видеть лишь небольшую зону гидролиза. (Фото 15).
Фото 15. Гистологический срез семенного канатика бычка №1. Хроническое течение безноитиоза. Показаны цисты B.besnoiti под эпителием семенного канатика. Хорошо видно, что эпителиальная ткань под давлением цисты атрофирована, а эпителий из кубического уже превращён в плоский. В верхней части препарата виден очажок зарождающейся новой цисты. Воспалительная клеточная реакция вокруг цист отсутствует. Окраска по Ван – Гизон.
В семенниках, лишь иногда можно было обнаружить незначительную инфильтрацию интерстициальной ткани за счёт гистиоцитов и фибробластов. В цитоплазме отдельных гистиоцитов можно было видеть безноитий. Проследить, каким образом формируются цисты в половых железах, нам не представилось возможным. Поскольку мы видели или внеклеточные колонии паразитов, или уже сформированные цисты. Внутриядерного размножения безноитий в семенниках мы не обнаруживали. Без сомнения остаётся одно, что цисты безноитий в семенниках являются результатом внеклеточного размножения и развития и по морфологии заметно отличаются от цист формирующихся в дерме (Фото 16, 17, 18 ).
Фото 16. Гистологический срез паренхимы семенника бычка №2. Видна выраженная дезорганизация эпителия канальца, гидролиз подэпителиальной ткани и формирование под эпителием канальца цисты. Часть безноитий видна внутри клеток и свободно находится в просвете канальца среди единичных сперматозоидов. Видно активное участие соединительной ткани в образовании гомогенной оболочки формирующейся цисты. Окраска по Ван – Гизону.
Фото 17. Гистологический срез придатка семенника бычка №2. Показано формирование наружной, гомогенной оболочки цисты исключительно из коллагеновых волокон соединительной ткани. Окр. По Ван – Гизону.
Фото 18. Гистологический срез семенника бычка №2. Хроническое течение болезни. В интерстициальной ткани, рядом с цистами, видна крупная вена и капилляр, заполненные большим количеством свободных, внеклеточных безноитий (Показано стрелками). Окр. Железным гематоксилином и эозином.
Морфологическое отличие цист в дерме от цист обнаруживаемых в семенниках выражается в том, что вокруг цист безноитий расположенных в семянниках менее выражен гидролиз коллагеновых волокон соединительной ткани. Это хорошо видно на наших фотографиях и на фотографии Oryan, A. обубликованной в книге «Comparative clinical pathology» появившейся в Интернет в 20011году, (сайт - Springerimages.com). На фотографии хорошо видно, что вокруг колонии паразитов видна только одна внутренняя мембрана и толстый зернистый слой (питательный слой в нашей интерпритации). Вокруг большинства цист гомогенный слой отсутствует, однако хорошо видны не гидролизированые коллагеновые волокна. Судя по окраске препарата, соединительнотканные волокна вокруг цист заметно отличаются от соединительной ткани расположенной между канальцами. Такая реакция соединительной ткани вокруг цист свидетельствует, как и в наших случаях, об изменении биохимической структуры волокон соеденительной ткани вокруг цист. На фотографии хорошо видно, что лишь вокруг одной цисты сформировался толстый слой из гомогенной массы. Интересно отметить, что в просвет вены отделяется колония паразитов вместе с внутренней мембраной (Фото 19).
Фото 19. Фото взято из книги А. Oryan «Comparative clinical pathology». Гистологический срез семенняка. На снимке авторы показывают выход цисты безноитий в просвет крупной вены . Наряду с этим на снимке хорошо видны все особенности морфологического строения цист безноитий в семянниках - цисты без толстой гомогенной оболочки, вместо них хорошо видны коллагеновые волокна; в нижнем левом углу видна циста с гомогенной толстой оболочкой .
Таким образом, данные наших исследований и имеющиеся публикации в открытой печати свидетельствуют, что паразиты интенсивно инвазируют не только кожу мошонки, но и строму (соединительную ткань) семенного канатика и семенников. Интересно отметить, что в наших случаях, речь идёт не об остром или подостром течении болезни, а уже хроническом заболевании. И, несмотря на это, паразиты обнаруживались нами как в виде достаточно хорошо сформированных цист, так и в виде внеклеточных колоний, цитоплазматических включений, и свободно в просветах крупных вен и капилляров. Цисты безноитий в семенниках, хотя и имеют общий план строения, но они заметно отличаются от таковых в дерме одних и тех же животных. Наши данные согласуются с морфологическим строением цист безноитий показанных на фотографии в работе (А. Oryan ). С чем связано такое различие в морфологическом строении цист в организме одного и того же животного остаётся пока загадкой, как остаётся неясным при этом и питание огромной колонии паразитов внутри цист. Морфологически цисты безноитий в семенниках и особенно строение их цистной оболочки, больше сходны с цистами токсоплазм в головном мозге животных. Разница заключается лишь в размерах цист. Если это действительно так, то можно предположить, что питательные вещества для колоний безноитий расположенных в семенниках, как и колоний токсоплазм в цистах, поступают из прицистной зоны, образующейся вокруг цист паразитов.
Важным фактом является обнаружение большого количества свободных безноитий в просветах кровеносных сосудов, а так же цист и свободных безноитий в просветах семенных канатиков. Б.П. Всеволодов и Э.И. Гаппаров (1960,1961, 1967) наблюдали внеклеточных безноитий в печени, почках, семенниках, лёгких, сердце и даже в головном мозге крупного рогатого скота. Все исследователи изучавшие безноитиоз крупного рогатого скота, едины во мнении, что излюбленным местом локализации B.bеsnoiti является кожа животных, а так же слизистая влагалища, склера, и семенники быков производителей. С чем это связано, в настоящее время, трудно объяснить. Ясно одно, что такая локализация B.bеsnoiti в организме хозяина способствует лучшей трансмиссии паразитов среди крупного рогатого скота жалящими насекомыми и половым путём, что было достоверно показано экспериментальными работами (Бигалке,1960; .Хван и Виноградов, 1966,1968). Такая трансмиссия B.bеsnoiti в природе, в какой – то мере, сближает их с пироплазмидами, гемоспоридиями и малярийным плазмодием. Разница заключается лишь в том, что клещи и кровососущие насекомые для безноитий являются только механическими переносчиками, тогда как для гемоспоридий, пироплазм и малярийного плазмодия эти насекомые являются дефинитивными хозяевами. Не исключено, что дальнейшая эволюция у B.bеsnoiti, может пойти по такому же пути, как и у выше перечисленных паразитов и тогда они найдут себе партнёра среди кровососущих насекомых для половой фазы развития. Возможен и другой вариант эволюции B.bеsnoiti - по кокцидиозному типу. Теоретически это возможно, поскольку у B.darlingi, B. wallacei, B. oryctofelisi эволюция паразитов идёт по эймериозному типу.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО РАЗДЕЛУ
Анализ публикаций последних 10 - 15 лет и данные наших исследований показывают, что безноитии крупного рогатого скота (Besnoitia besnoiti), по морфологии, эндогенному циклу размножения и циркуляции их в природе сходны с токсоплазмами, неоспорами и саркоспоридиями. В то же время, B. вesnoiti заметно отличается от всех токсоплазмоподобных паразитических простейших. В первую очередь необходимо отметить, что у безноитий крупного рогатого скота, отсутствует половая фаза развития и размножения, сходная с таковой у других токсоплазмид. Из шести известных видов безноитий у трёх была описана половая фаза развития по типу токсоплазмид - у B.darlingi, B. wallacei, B. oryctofelisi. Интересно отметить, что изоспоры Besnoitia sp. заражают мышей как перорально, так и внутрибрюшинно. При этом во внутренних органах безноитии проходят эндогенную фазу своего размножения сходную с таковой у токсоплазм, неоспор и саркоспоридий, которая завершается формированием тканевых цист размножения. Обнаружение такого цикла развития мышиных безноитий, ещё ближе сближает паразитов рода Besnoitia с токсоплазмидами и свидетельствует о том, что мышиные безноитии нашли своего «напарника» для полового развития и размножения в кишечнике кошки, тогда как другие виды находятся ещё в поиске своих «напарников».
Безноитии крупного рогатого скота (B. вesnoiti) занимают уникальное положение в системе простейших. С одной стороны у них отсутствует половая фаза развития, с другой, у B. вesnoiti резко выражены все особенности эндогенного развития и размножения не только токсоплазмид, но и гемоспоридий. Эти особенности следующие:
- B. вesnoiti, в первую очередь, это паразиты крови и РЭС. При попадании в организм животного, фаза пролиферации, начинается с размножения и развития в клетках крови – лейкоцитах, лимфоцитах и моноцитах.
- B. вesnoiti могут размножаться как внутри цитоплазмы инвазированных клеток, так и в их ядрах.
- B. вesnoiti, в фазу формирования псевдоцист являются паразитами клеток РЭС, а в фазу формирования тканевых цист могут размножаться также в ядрах клеток соединительной ткани, гладкомышечных волокон, ядрах росткового слоя эпидермиса.
- B. вesnoiti, как токсоплазмы и саркоспоридии, в фазу формирования цист могут размножаться как внутриклеточно, так и внеклеточно.
- У B. вesnoiti более демонстративне, чем у других токсоплазмид, выражена фаза пролиферации (фаза трофозоита), фаза образования псевдоцист и фаза образования тканевых цист.
- B. вesnoiti, в фазу интенсивного размножения – это строго внутриклеточные паразиты с выраженной цитоплазматической паразитофорной вакуолью. Трофозоиты безноитий обладают способностью, вначале проникновения в клетку организма хозяина, активизировать обменные процессы в инвазированной клетке и вызывать её гипертрофию.
- B. вesnoiti, в фазу формирования внутриядерных псевдоцист, по – видимому, начинают выделять какие то – ферменты, которые подвергают гидролизу не только цитоплазму инвазированной клетки, но и все окружающие ткани, включая и их ядра, превращая все ткани расположенные вокруг формирующейся псевдоцисты, в эмбриональную, гомогенную слизистую массу богатую белками, мукополисахаридами и рибонуклеиновыми кислотами.
Следует особо подчеркнуть, что положительная пиронинофильная реакция гомогенной массы не исчезает при обработке препарата РНКазой, тогда как в самих паразитах и цитоплазме воспалительного пролиферата положительная реакция на РНК, практически, исчезала. Этот факт свидетельствует, что паразиты не пассивно ассимилируют нуклеиновую кислоту из питательного слоя, а синтезируют их из блоков образовавшихся при гидролизе окружающих клеток и тканей
В связи с этим важно вспомнить работу J.S. Remington и др.(1970), которые путём биохимических исследований показали, что внеклеточные токсоплазмы могут синтезировать РНК и в отсутствие клеток организма хозяина. Авторы пришли к очень важному выводу о том, что токсоплазмы обладают необходимыми механизмами для синтеза предшественников РНК и полимеризации их в собственную РНК вне клеток организма хозяина. Не к менее важным выводам пришли J.Perroto и др. (1971). Они при биохимических исследованиях синтеза ДНК у токсоплазм показали, что эндозоиты токсоплазм могут активно ассимилировать экзогенные пурины для синтеза собственной ДНК. Таким образом, и группа учёных во главе с Ремингтоном, и группа исследователей во главе с Перрото, независимо друг от друга, пришли к очень важному выводу о том, что внеклеточные токсоплазмы, независимо от клетки хозяина могут синтезировать ДНК и РНК из внеклеточного субстрата. Их данные, в какой – то мере, согласуются с результатами электронной авторадиографии с использованием 3Н – тимидина, проведённого T.Kishida и S.Kato (1965), которые показали, что у токсоплазм развивавшихся в культуре клеток, предшественники ДНК не включаются в ядро паразита находящегося внутри клетки, тогда как в ядра культуральных клеток наблюдалось интенсивное включение метки. Эти исследования очень важны для понимания биохимических процессов протекающих вокруг внутриклеточных и внеклеточных паразитов в организме крупного рогатого скота при безноитиозе. Кроме того, они важны и для понимания внеклеточного развития и размножения токсоплазм при формировании цист в головном мозге (А.Бугаев, 2005).
Учитывая морфологическое сходство безноитий с токсоплазмами, можно предположить, что и у B. вesnoiti, так же есть механизмы для внеклеточного синтеза не только предшественников РНК и ДНК, но и других биохимических компонентов. В случае с безноитиями крупного рогатого скота – это синтез из гомогенизированной, слизистой ткани, образовавшейся в результате гидролиза такней окружающих псевдоцисты. Основываясь на исследованиях Ремингтона, и Перрото о внеклеточном синтезе токсоплазмами нуклеиновых кислот, можно объяснить и результаты наших гистохимических исследований обнаруженных при развитии и размножении B. вesnoiti. По – видимому, такие механизмы синтеза, имеются и у других токсоплазмид, однако в этом направлении исследования ещё не проводились.
Важным моментом в эндогенном цикле B.bеsnoiti является внутриядерное размножение и развитие безноитий. Какое значение имеет этот феномен в жизни паразитических простейших пока достоверно не известно. Можно лишь назвать несколько работ, в которых упоминается о внутриядерном размножении паразитических простейших – это серия работ профессора В.Л. Якимова(1931) по лейшманиозу, в которых он описывает размножение этих паразитов в ядрах лимфоцитов и работы Г.Т. Акиншиной и др.(1969), Г.Т. Акиншиной и Д.Н.Засухина (1971) описавших внутриядерное размножение В. Jellisoni в клетках перевиваемых культур. Однако конкретных суждений этому феномену в доступной литературе мы не нашли. Есть только констатация факта.
ВЫВОДЫ
Анализ доступной нам литературы и публикаций в Интернет по морфологии, размножению и эндогенному размножению безноитий крупного рогатого скота, а так же данные наших собственных исследований даёт основание, в отношении B.bеsnoiti сделать следующие выводы:
ПЕРВЫЙ. У безноитий крупного рогатого скота (B.bеsnoiti) отсутствует половая фаза размножения и развития по типу эймерий или так называемых «классических кокцидий». По крайней мере, на сегодняшний день, данных о наличии полового размножения у B.bеsnoiti не обнаружено. Несмотря на многочисленные исследования проведённые с целью установления дефинитивного хозяина у B.bеsnoiti. Данные В.М.Петешева и А.П. Поломошного(1974), на которые ссылаются некоторые исследователи, никем в течение 40 лет не подтверждены.
ВТОРОЙ. У B.bеsnoiti чётко выделяется фаза строго внутриклеточного и фаза внеклеточного размножения и развития.
Фаза внутриклеточного размножения проходит в два этапа – первый в лейкоцитах крови (лимфоцитах, моноцитах и сегментоядерных лейкоцитах); второй - в клетках ретикулоэ - эндотелиальной системы – гистиоцитах, спленоцитах, адвентициальных и эндотелиальных клетках кровеносных и лимфатических сосудов различных органов. При этом безноитии крупного рогатого скота (B.bеsnoiti), размножаются, как в цитоплазме этих клеток, так и в их ядрах. И в этой фазе размножения и развития они имеют большое сходство с Theilria, Leismania, Schizotripanum и Heemoproteus, которые принадлежат к различным систематическим группам – тейлерии к пироплазмам, а три последних к типичным жгутиковым.
ТРЕТИЙ. В организме крупного рогатого скота B.bеsnoiti проходят три стадии развития и размножения: стадию трофозоита или активного размножения, поэтому таких паразитов иногда называют тахизоитами; стадию формирования ядерных псевдоцист и внеклеточную стадию колониального развития и размножения завершающеюся формированием тканевых цист. В псевдоцистах и цистах, в безноитиях происходит накопление амилопектина и темп размножения их уменьшается, поэтому таких паразитов называют брадизоитами. В цистах безноитии бесконечно долго могут размножаться и развиваться, поэтому их, как и цисты токсоплазм, можно называть цистами размножения. Если в фазу пролиферации B.bеsnoiti - это паразиты лейкоцитов и клеток РЭС. То, в фазу формирования ядерных псевдоцист, безноитии способны размножаться и в других клетках организма хозяина и в перую очередь в ядрах гладкомышечных волокон.
ЧЕТВЁРТЫЙ. У B.bеsnoiti пролиферативная фаза размножения трофозоита, как и у токсоплазм, завершается образованием псевдоцист в лейкоцитах и клетках РЭС, но не в цитоплазме инвазировнных клеток, а в их ядрах. Мы не разу не наблюдали у B.bеsnoiti цитоплазматических псевдоцист, хотя размножение безноитий обнаруживали в цитоплазме моноцитов, средних и крупных лимфоцитов и даже в цитоплазме плазмоцитов. У B.bеsnoiti образование псевдоцист, по – видимому, является фазой жизненного цикла детерминированной генетически и не зависит от иммунного состояния организма хозяина. Сравнивая эту стадию развития и размножения B.bеsnoiti с другими паразитическими простейшими, можно заметить, что она сходна с таковой у тейлерий крупного рогатого скота при образовании «плазматических шаров» Коха.
ПЯТЫЙ. Фаза формирования ядерных псевдоцист B.bеsnoiti в дерме крупного рогатого скота, сопровождается резко выраженной пролиферативной реакией со стороны клеток РЭС и гомогенизацией (гидролизом) всех тканей и клеток, включая и их ядер, которые находятся рядом с ядерной псевдоцистой. Способность B.bеsnoiti размножаться внутри ядер клеток хозяина и одновременно гидролизовать окружающею ткань, является одной из загадок и особенностей этого паразита не встречаемой ни у одного представителя эймерид, ни у представителей гемоспоридий и пироплазмид. Процесс гидролизации и формирования колониальной зоны питания (колониальной внеклеточной паразитофорнной вакуоли) - это факт совершенно новый в мире паразитических простейших и он сближает B.bеsnoiti с такими паразитами как токсоплазмы, саркоспоридии и неоспоры. В то же время, такая выраженная способность B.bеsnoiti превращать окружающие ткани и клетки в гомогенную слизистую массу, напоминает сходные процессы у колониальных свободно живущих простейших - вольвоксов. Последние принадлежат к отряду вольвоксные класса зелёные водоросли и по признанию многих учёных являются связующим звеном между одноклеточными и многоклеточными животными. Какое значение колониальное размножение и развитие имеет в эволюции токсоплазмид пока не ясно?
ШЕСТОЙ. После фазы внутриядерной пролиферации и образования паразитами ядерных псевдоцист, у B.bеsnoiti наступает фаза внеклеточного, колониального развития и размножения. В результате такого действия вокруг многочисленной колонии, паразиты формируют сложной структуры оболочку, которая не только удерживает и сохраняет колонию паразитов, но и даёт возможность паразитам внутри цисты питаться, размножаться и развиваться. Причём внутри колонии B.bеsnoiti прослеживается определённая «специализация» брадизоитов – в центре колонии безноитии способны размножаться, те же которые расположены по периферии колонии, активно участвуют в формировании внутренней мембраны, будущей оболочки цисты и зернистого слоя, путём «сознательного» умирания в целях сохранения колонии паразитов.
СЕДЬМОЙ. Циста B.bеsnoiti - это сложное «архитектурное» образование, конструкция (дом, кокон) колонии паразитов. Этот «дом» строится самими паразитами за счёт материала (клеток и тканей) крупного рогатого скота. B.bеsnoiti строят «цисту - дом» для себя, для своего размножения и развития. Организм хозяина в этом процессе принимает пассивное участие, как «поставщик» строительного и питательного материала для колонии паразитов. Образование цист B.bеsnoiti является фазой их жизненного цикла в организме крупного рогатого скота. Сам процесс формирования цист B.bеsnoiti и развитие в них паразитов, сходен с таковым с токсоплазмами, неоспорами и саркоспоридиями.
ВОСЬМОЙ. Наружный слой цисты B.bеsnoiti - это не соединительнотканная капсула, которая образуется организмом хозяина, как например, вокруг туберкулезных палочек, для купирования возбудителя болезни, которая со временем может превратиться даже в костную ткань. Наружная оболочка цисты безноитий – это живое образование, построенное колонией паразитов из гомегенной (слизистой) массы. Гомогенная масса образуется при гидролизе всех клеток и межклеточного вещества, включая и волокна соединительной ткани находящихся вокруг колонии паразитов и ядерных псевдоцист. Поэтому содержит все необходимые для паразитов питательные вещества. Наружный, толстый слой цисты, с одной стороны, защищает колонию паразитов от «агрессивного» воздействия организма хозяина, с другой - он даёт возможность питаться огромному числу паразитов находящихся внутри цисты. Отсюда вытекает очень важное следствие – в этом «доме» хозяевами являются паразиты. Они не только могут размножаться и развиваться в цисте, но и при определённых обстоятельствах свободно покидать её, вызывать тем самым обострение инвазионного процесса. Этот процесс хорошо был продемонстрирован в работе ( Френкель,1953) на примере безноитиоза мышей, вызванного паразитами В. Jellisoni. При исследовании биопсийного материала мы так же нередко наблюдали картины выхода мерозоитов из цист безноитий в окружающюю ткань.
ДЕВЯТЫЙ. Гомогенизированная масса, образующаяся вокруг ядерных псевдоцист и сформировавшихся цист - это не дистрофический субстрат вроде фибриноидно перерожденной (мёртвой ткани) или ценкеровского некроза. Это живой субстрат, напоминающий эмбриональную слизистую ткань, содержащею высокий уровень нуклеиновых кислот, белков и особенно мукополисахаридов. Из этой гомогенной массы формируется питательная зона (колониальная, внеклеточная паразитофорная вакуоль) для дальнейшего питания колонии паразитов.
ДЕСЯТЫЙ. Проведённые гистохимические исследования B.bеsnoiti показали динамику метаболических процессов на разных стадиях размножения и развития паразитов в организме крупного рогатого скота. В фазу пролиферации, трофозоиты(тахизоиты) - это строго внутриклеточные, цитоплазматические паразиты и подчиняются всем биологическим законам метаболизма внутриклеточной паразитарной клетки. А именно, проникнув в клетку организма хозяина (в цитоплазму или ядро), паразиты формируют вокруг себя паразитофорную вакуоль и синтезирует из неё питательные вещества необходимые паразитарной клетке. Трофозоиты B.bеsnoiti, вначале инвазирования клетки, даже «научились» вызывать её метаболическую активность, что морфологически проявляется заметной гипертрофией клетки (Френкель и Полс 1953, 1954, 1960). Факт гипертрофии инвазированной клетки, по – видимому, является закономерным не только для B.bеsnoiti, но и для других паразитических простейших. Так, В.Л. Якимов в своей монографии, изданной в 1931 году, обратил на это внимание, описывая шизогонию в эндотелиальных клетках при гемоспоридиозе голубей (Haemoproteus columbae). Л.А. Бугаева(1974) наблюдала гипертрофию и повышенный синтез РНК и общего белка в цитоплазме мезотелиальных клеток белых мышей инвазированных токсоплазмами. Т. В. Бейер и Т.А. Шибалова (1978), изучая цитохимические особенности E.tenela отметили, например, шестикратное увеличение синтеза ДНК в клетках инвазированных этими паразитами. Однако такая активизация обменных процессов в инвазированной клетке быстро проходит и сменяется тяжёлой дистрофией инвазированной клетки, разрывом её цитоплазматической оболочки и выходом из клетки образовавшихся мерозоитов.
ФАКТ ОДИНАДЦАТЫЙ. Общий план формирования тканевых цист B.bеsnoiti в разных органах одного и того же животного сохраняется, однако в деталях может отличаться, как у разных видов животных, так и в разных органах одного и того же животного. Примером этому может служить образование тканевых цист в дерме и семянниках крупного рогатого скота. С чем это связано, пока трудно объяснить, толи с особенностями органов и тканей организма хозяина, толи с уникальными свойствами паразитов?
Телефон для контакта - (044) – 426 – 47 – 76 (78).
Email: bugaev@ukr.net
- © 2013-2015 www.vetbugaev.kiev.ua
- Все права защищены.
- Использование любых материалов, размещённых на сайте, разрешается при условии ссылки на www.vetbugaev.kiev.ua
- При копировании материалов со страницы www.vetbugaev.kiev.ua для интернет-изданий – обязательна прямая открытая для поисковых систем гиперссылка. Ссылка должна быть размещена в независимости от полного либо частичного использования материалов. Гиперссылка (для интернет- изданий) – должна быть размещена в подзаголовке или в первом абзаце материала.
Обновлено (22.05.2015 07:29)